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1、细胞工程知识点1、细胞工程：以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有 目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一 门综合性科学技术。2、细胞工程的应用：1）动植物快速繁殖技术：植物组织培养、人工种子、试管动物、克隆动物2）新品种的培育：细胞融合、细胞水平的重组3）细胞工程生物制品：单克隆抗体制备、疫苗生产4）细胞疗法与组织修复：2细胞工程理论基础1、细胞全能性：每个活的体细胞都具有像胚性细胞那样，经过诱导能分化发育 成为一个新个体的潜在能力，并且具有母体的全部的遗传信息。2、细胞分化：指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程。3、细胞的脱分化：在一定
2、营养和刺激因素作用下，具有特定结构与功能的植物组 织的细胞被诱导而改变原来的发育途径，逐步失去原来的分化状态，细胞特性消失, 转变为具有分生机能的细胞，并进行活跃的细胞分裂，这一过程称为去分化。3细胞工程技术1、实验室条件：组成：准备室、无菌间、操作间、培养室、分析室。2、无菌技术、显微技术、细胞观察与分析、细胞分离、细胞保存与复苏（1）细胞保存方法 传代培养保存法 低温冷冻保存法（低温、超低温保存）液体固化的方式（形成冰晶、形成无定型的玻璃化状态）玻璃化指液体转变为非晶态（玻璃态）的固定化过程，在此状态时，水分子没 有发生重排，不产生结构和体积的变化，因此不会由于机械或溶液效应造成组织 和细
3、胞伤害，化冻后的细胞仍有活力。冷冻方法（缓慢冷冻法、快速冷冻法预冷冻法包括逐级冷冻和两部冷冻） 细胞复苏按一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到常温的过程。复苏细胞厂般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水 分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。细胞培养和代谢调控：1、细胞培养：模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研 究。2、细胞培养的操作方式：分批式培养、流加式培养、半连续式培养、连续式培 养、灌流式培养。3、分批式培养（植物细胞培养）：分批式培养过程的环境随时间变化很大，可分 为
4、延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段。4、流加式培养（适合植物）：随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新 的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。5、半连续式培养（动物细胞）：定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连 同细胞、载体一起取出。6、连续式培养：该模式是将细胞接种于一定体积的培养基后，为了防止衰退期 的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基； 同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒 定。理论上讲，该过程可无限延续下去。7、灌流式培养：灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，
5、在细胞增长 和产8、物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的 培养基。（动物细胞）9、代谢工程：通过某些特定生化反应的修饰来定向的改善细胞的特性，或是利 用重组DNA技术创造新的化合物。它是利用基因工程或是分子生物学技术、将 生物技术内的代谢路径改变，通常改变生体内化学反应的酶。代谢工程技术目前 以微生物利用为主，改变工业微生物的代谢路径，生产所需要的化学物质，如抗 生素。10、逆代谢工程：是一种采用逆向思维方式进行代谢设计的新型代谢工程。就是 先在异源生物或相关模型系统中，通过计算或推理确定所希望的表型，然后确定 该表型的决定基因或特定的环境因子，然后通过基因改造或
6、环境改造是该表型在 特定的生物中表达。植物人工繁殖11、植物组织培养：是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根尖、茎尖、 叶、花、未成熟的果实、种子等）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体 细胞、生殖细胞等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配置 的培养基上，给予适当的条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整 植株的一种实验技术。也称植物离体培养或试管培养。12、植物组织培养再生植株的途径：1）.器官发生途径：离体培养的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不 定芽等器官的过程2）体细胞胚发生途径：从体细胞产生胚状体的过程13、植物组织培养的问题：玻璃化、褐化
7、问题、微生物污染问题。14、玻璃化问题解决方案：1）利用固体培养基，增加琼脂浓度，选择适当的碳源，提高培养基中蔗糖含量，从 根本上降低培养基中的渗透势，造成细胞吸水阻遏，减少培养基中植物材料可获得 的水分；2）采用通气性好的封口材料如纱布、脱脂棉等代替聚乙烯塑料膜作为封口材料， 可降有效低培养容器内部环境的相对湿度，减轻有害气体的积累，使植物光合作用 顺畅。3）非受伤的物理和化学协迫可以增加乙烯的合成。乙烯促进叶绿素分解及细胞 的畸形发展。乙烯处理破坏膜的结构，解离细胞壁，细胞内积累有少量纤维素及 泡状物质。4）培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA浓度越高或培养温度越 高，玻璃苗比
8、率越大。选择搭配合适的激素，适当降低培养基中BA的浓度均可 减轻玻璃苗的出现。通过培养条件（温度和光照）减少玻璃苗的发生。适当低温处 理可消除玻璃化，提高光照强度,适当延长光照时间,充分利用自然光照也可以减 低玻璃苗的发生频率。5）在培养基中减少或除去NH4NO3,附加活性炭、青霉素、聚乙烯醇（PVA）、 Ca、赤霉素（GA）及多效唑（PP333）等，减少继代培养的次数等措施均可降低观 赏植物组培过程中玻璃苗的发生。15、褐变解决途径:、1）选取适宜的外植体2）选择适宜的培养条件3）细胞筛选和预处理4）使用抑制剂（Vc、柠檬酸、巯基乙醇、谷胱甘肽、DTT等）5）使用吸附剂（活性炭、PVP等）1
9、6、微生物污染问题防治措施：1）改进外植体消毒方法2）反复检查培养物是否污染3）使用抗生素（用两性霉素B、青霉素、链霉素）17、人工种子三部分：人工种皮外层，保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部 力量冲击；人工胚乳，含有必需的营养成分和某些植物激素；胚状体或芽。18、极性现象：由细胞的电场方向决定的。因为电场方向决定着细胞内的物质分 配，这些物质包括无机盐类、蛋白质、核糖核酸等一些带电荷物质。同时，生长 素的梯度、pH梯度、渗透压大小、机械压、光照等都能使细胞形成电场，特别 是膜上和Ca2+结合的蛋白质带有净的电荷，它在细胞内电场的建立中起着非常 重要的作用。19、植物激素的作用：（1）由IA
10、A和一些CTK的组合对愈伤组织根和芽的诱导。由IAA和GA3 （赤霉素）在维管组织分化中的相互作用。（3）由IAA对茎中皮层和髓组织内以及愈伤组织内维管束的诱导。（4）茎组织对IAA的反应有不定根的发生。（5）由GA3、IAA和乙烯对开花的诱导和性别的控制。20、细胞分化的调控机制：1）细胞分化基因表达的主要调节发生在转录水平，而不是翻译水平。2）调节细胞中转录过程的因素是非组蛋白，组蛋白使基因转录过程关闭，非组蛋 白使部分基因转录过程打开。21、植物胚胎培养：对植物的胚及胚器官（如子房、胚珠）进行离体无菌培养、 使其发育成幼苗的技术。包括：成熟胚培养、幼胚培养、子房培养、胚乳培养和 试管受精
11、等。22、植物脱毒方法：1）物理法：高温处理、低温处理2）化学法：利用嘌吟和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等化学药品处理患病植物 来抑制植物体内病毒的复制。3）生物学方法：茎尖培养、微体嫁接法、通过愈伤组织培养、珠心培养法、花 药培养脱毒。动物人工繁殖1、体外受精：是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精 过程的技术。2、试管动物培育过程：（1）精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养。（2）体外受精（3）胚胎体外培养（4）胚胎移植（5）体外发育、出生3、胚胎移植：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排 卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术。4、人工受精：
12、将采集的精子注入发情处理的母体内完成受精过程。5、人工受精繁殖动物的意义：1）提高优秀种公畜的利用率2）加速品种改良3）家畜配种不受时间和地域限制4）大幅度减少种公畜的饲养数量5）克服公母畜体型悬殊和种间交配困难6）防止疾病传播7）有利于提高母畜的受胎率5、人工授精技术3个环节：采精、精液处理和输精。6、细胞核移植克隆动物的技术路线：1）核供体细胞的准备2）受体细胞的去核3）细胞核移植、激活4）重组胚的培养与移植5）核移植后代的鉴定7、胚胎冷冻保存方法：程序冷冻法、玻璃化冷冻法。主要的冷冻损伤机制包括：一溶液效应造成化学损伤二是细胞内结冰造成物理 损伤三是细胞渗透压异常损伤。冷冻保护剂：渗透型
13、冷冻保护剂属于细胞内液抗冻保护剂：甘油、二甲亚砜非渗透型冷冻保护剂葡萄糖、二糖（蔗糖）、三塘（棉子糖）、聚乙烯毗咯烷酮、清蛋白注：抗冻蛋白8、精子冷冻保存方法：常温保存、低温保存、冷冻保存9、卵母细胞保存：玻璃化冷冻法、一步冷冻法、超快速冷冻法细胞重组与细胞融合1、细胞质工程：是研究真核细胞的核-质关系以及细胞器、细胞质基因转移的技 术。2、细胞质融合：也叫细胞杂交，是使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并 形成一个细胞的技术。3、细胞质融合方法：1）生物法：病毒诱导细胞融合2）化学法：聚乙二醇诱导、脂质体法3）物理法：电融合诱导法4、病毒诱导细胞融合的优缺点：优点：操作简单、成本低。缺点：要
14、提前大量 培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分， 病毒可能感染操作者与亲本细胞5、聚乙二醇介导的细胞融合优缺点：优点：融合成本低，无需特殊设备；融合 产生的异核率较高；融合过程不受物种的限制。缺点：融合过程繁琐，聚乙二醇 可能对细胞有害。6、点融合诱导法的优缺点：优点：融合率高、重复性和可操作性强。缺点：可 能会造成不可恢复的细胞损伤。新品种的培育1、体细胞杂交：是指将不同来源地体细胞融合并使之分化再生，形成新品种的 技术。2、多倍体育种的方法：1）化学方法：一些化学物质可以阻止卵母细胞第二极体生物释放或细胞分裂而 产生多倍体。常用的化学物质有：细胞松弛素、秋水
15、仙素、聚乙二醇等。2）物理方法：主要包括温变激变、机械创伤、辐射、水静压法和高盐高碱法等、3）生物法：指体细胞杂交，利用染色体加倍个体和为加倍个体杂交繁殖多倍体 后代，常与物理化学法结合使用。3、雌核发育：精子经过处理使用其核不参与受精卵卵球的发育，胚胎的发育仅 在母体遗传的控制下进行的一种发育方式。4、雄核发育：卵细胞不受精，卵核消失，或卵细胞受精前失活，由精核在在卵 细胞内单独发育成单倍体，因此只含有一套雄配子染色体。、5、雌核发育存在的问题：人工雌核发育的后代成活率较低，有的个体还有雌雄 间性的特征。6、.植物离体受精：指体外无菌条件下培养未受精的子房、胚珠和花粉、使花粉 萌发进入胚珠完成受精的技术。包括离体传粉和体外受精两类。7、胚胎嵌合：将两枚胚胎细胞（同种或异种动物胚胎）融合共同发育成为一个胚 胎为嵌合胚胎。将该胚胎移植给受体，妊娠产仔，如该仔畜具有以上两种动物胚 胎的细胞称之为嵌合体动物。植物细胞代谢产物制备1、植物细胞悬浮培养的生物反应器分为两大类：1）机械搅拌式生物反应器
