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1、实验报告大蒜茎尖的组织培养谢婷婷江宋青万嫣文吕凌宇一、实验目的掌握植物组织培养的相关理论知识及操作方法；通过自行设计并完成实验，提高动手能力和思维能力；利用植物细胞的全能性，使大蒜茎尖经过脱分化作用形成愈伤组织，再分化为有结构的组织和器官，最终增殖培育岀大量品质优良的大蒜试管苗。二、实验原理植物组织培养是利用植物细胞的全能性原理。植物组织培养是在无菌环境下，将离体的植物器官、组织以至单个细胞，在人工配置的培养基上培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的 过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构 的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为脱分化”
2、。已经脱分化的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称再分化”。三、实验材料、试剂和器材1供试材料以购于府前菜场的大蒜为实验材料，实验在丽水学院生态学院组培实验室进行。2仪器与设备超净工作台、培养事、电子天平、烧杯、容量瓶、玻璃棒、量筒、移液管。3试剂70%酒精、95%酒精、0.1%升汞、蔗糖、琼脂条、6-BA (1.5 mg/L ; 2.0 mg/L )、2,4-D (2.0 mg/L )、 NAA (1.0 mg/L ;)、IBA (2.0 mg/L )、10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100 倍的有机物。四、实验步骤1.培养
3、基 的配制及灭菌诱导培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L生根培养基： MS+IBA 2.0 mg/L（1） 将 MS 母液（ 10倍的大量元素、 100倍的微量元素、 100 倍的铁盐、 100 倍的有机物）按顺 序排列、检查是否失效。（ 2） 在装有 3/4 蒸馏水的容器中加入 0.7%琼脂和 3%蔗糖，加热溶化。（ 3） 依次吸取适量各种母液移到容器中。（ 4） 用蒸馏水定容到相应体积。（5） 调节pH值佣0.1M的NaOH或HCI调节）至5.8-6.0。（ 6） 向培养基中加入适量激素。（ 7） 将配制好的培养基进行分装（ 20-30mI/ 瓶）。（8）
4、用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 C下灭菌20 min。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（烧杯、培养皿、灭菌水等）， 需同时灭菌。（ 9） 将灭菌后的培养基于常温下放置一星期，观察有无污染。2 外植体的选取和消毒将大蒜剥去膜质外皮，选取完好的蒜瓣，放入加有洗洁精的自来水中浸泡30min，再用自来水冲净。期间，用水和肥皂清洗双手，穿上鞋套进入无菌操作室，打开超净工作台的紫外灯，进行消毒灭菌 20min ，然后关闭紫外灯。将洗净后的蒜瓣放入无菌的空培养瓶中，带入无菌超作室。用70%的酒精擦拭双手及超净工作台，点燃酒精灯。把剪刀、镊子等放入95
5、%的酒精中，在火焰上灭菌。将装有洗净后的大蒜的培养瓶放到台面上进行消毒。由于大蒜蒜瓣较多，为使消毒彻底，将蒜瓣分成两批分装到两个已灭菌的烧杯中。先用70%酒精消毒30s，倒掉酒精，再用 0.1%的升汞消毒10min，用无菌水冲洗 5 次。将大蒜消毒灭菌后，取出放到装有滤纸的培养皿上。将接种器材从90%的酒精中取出，放到酒精灯外焰上至上而下灼烧，放在培养皿上冷却。之后，用无菌器械把蒜瓣纵着切开，小心地用 解剖刀和镊子切去蒜瓣肉质鳞片及稍大的叶片，取出蒜瓣内的茎，切取2-3mm 的茎尖作为外植体。3 愈伤组织的诱导打开培养基，用火焰灼烧一下培养基的瓶口和瓶盖，用镊子夹住外植体，插入培养基中，每瓶接
6、种 5 个茎尖。再灼烧一下瓶口和瓶盖，拧好盖子。观察愈伤组织的诱导情况。4 继代培养待产生的愈伤组织长到直径 23cm 时，将其从培养瓶中取出，将其切成适当大小。打开培养基， 用火焰灼烧一下培养基的瓶口和瓶盖， 将切好的愈伤组织接入诱导培养基中继续培养，每瓶接种 3块。再灼烧一下瓶口和瓶盖，拧好盖子。观察增殖情况。5不定芽的诱导将继代培养后的愈伤组织从培养瓶中取岀，切成1 cmxi cm的小块，打开培养基，用火焰灼烧一下培养基的瓶口和瓶盖，将切好的愈伤组织接入岀芽培养基中，每瓶接种3块。再灼烧一下瓶口和瓶盖，拧好盖子。观察出芽情况。6根的诱导打开培养基，用火焰灼烧一下培养基的瓶口和瓶盖，选取生
7、长旺盛的再生芽，从其基部与愈伤组 织切离，接种于生根培养基中生根，每瓶接种1个芽，再灼烧一下瓶口和瓶盖，拧好盖子。观察生根情况。7观察培养物的生长状况每隔两天观察一次，检查其生长状况和被污染情况。及时照片记录其生长情况（将培养瓶放在固 定的位置，用相同的焦距拍下）。污染状况根据培养基的状况和外植体的表现来决定。五、实验结果各阶段培养物的污染率与成活率时间培养阶段污染率成活率11.18-11.22初代培养47%53%11.23-12.19继代培养31%69%12.20-出芽培养/生根培养/11月11日配置了诱导培养基并进行灭菌，一个星期后（11月18日）未发现培养基有污染，因此开始进行实验材料的
8、处理，取大蒜蒜瓣内的茎尖将其接到诱导培养基中，共接种了15瓶培养基，置于培养室内培养。四五天后，我们观察到部分培养基中接进去2-3mm的茎尖外植体开始膨大，已长岀愈伤组织，如图1所示。同时，由于茎尖最尖端的细胞快速的分裂生长，部分外植体长成类似芽状，有2-3cm高，如图2。经分析，该外植体正好是茎尖最顶端部分，其细胞生长伸长较快，再加之培养基营养丰富， 以至该外植体细胞能快速的分裂生长。然而，此部分仅是细胞的生长伸长，还未诱导岀结构松散的呈 细胞团状的愈伤组织。期间，由于部分培养瓶已污染，留有的愈伤组织不多。为增殖岀更多的愈伤组 织，我们挑选出长势较好的愈伤组织，在无菌室中取出培养瓶中的愈伤组
9、织，将其切割、离体后接种 至新的培养基中进行继代培养。3、图 4 所示。其表现为绿十天后，大部分培养瓶茎尖基部切口边处都已诱导出愈伤组织，如图 色、卵圆形、表面光滑的突起，突起大小不一，或密集或零散的分布于外植体切口的附近。而部分绿 色的愈伤组织周围还长有白色的组织，这是接种切取大蒜蒜瓣内的茎时部分茎段外紧贴着的几层白色 的细胞而长出的。图 3 图4 一个月左右后，初代培养中的外植体大部分已诱导出愈伤组织，少部分可能由于外植体的自身因 素的影响，诱导出的愈伤组织很小， 或诱导出的不是愈伤组织 （如图 1 中的芽状结构依旧保持该状态） 。 而经继代培养的愈伤组织不断膨大，最终形成了直径1cm ，
10、长2-3cm 左右的愈伤组织，如图5-8。此时我们将愈伤组织转移至出芽培养基，以诱导其产生丛生芽。图5图 6图7图 8至 12 月 26 日，此次设计性实验结束。由于时间的限制我们小组的实验仅做到这一步，即愈伤组 织未再分化出芽。经统计后，经继代培养或初代培养的愈伤组织接到出芽培养基中的培养瓶一共有 9 瓶，每瓶培养基中接有 3 块愈伤组织。而未转接到出芽培养基中的培养瓶（即依旧进行初代培养的培 养瓶）有 7瓶，每瓶中大概接有 3-5 个外植体，其诱导的愈伤组织很小或者几乎没有。通过查阅参考 文献等资料，我们发现采用大蒜茎尖进行快繁培养，其愈伤组织的形成也大概要 30 天，而愈伤组织 则需继续培养 50-60 天，才能长出披针形的叶片，还待继续培养才能发育成芽簇。因此，实验中接入 出芽培养基中的愈伤组织还需继续培养才能再分化出芽。我们小组实验在 11 月开展的，实验仅仅进行了一两个月的时间。实验的选材和方案的设计花费 的时间过长，在开展这项实验之前我们曾以鸡冠花种子、向日葵种子为实验材料，但因污染或未诱导 出等各种原因放弃，最后决定以大蒜茎尖为外植体进行组织培养。实验开展的太晚对实验进展有很大 影响
