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1、花鲈肌肉和肝脏组织细胞原代培养1. 细胞培养准备工作准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。具体工作如下：一、 清洗（1） 常用器具：细胞培养瓶、细胞培养板、培养皿、广口瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、电子天平、纱布、脱脂棉、止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀、解剖针、注射器、注射器过滤器、移液枪、枪头、离心管、细胞冻存管、酒精灯、试管架、超净工作台、倒置显微镜、生化培养箱、烘箱、液氮罐、封口膜、喷壶、以及洗刷用品等。（2） 玻璃器皿清洗：烧杯、量筒、玻璃棒、广口瓶（瓶盖不泡盐酸，清洗赶紧后直接高压灭菌）等玻璃器
2、皿自来水刷洗，除去灰尘，烤箱中烘干，然后再浸入5稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净，然后用蒸馏水冲洗干净后用烤箱烘干，高压灭菌，烘干备用。（3） 塑料器皿的清洗：细胞培养皿、培养板、培养瓶可以直接使用，进口枪头、进口离心管高压灭菌。（4） 金属制品的清洗：止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀等先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用。（5） 棉织品：纱布和脱脂棉，高压灭菌，再烘干备用。二、 溶液配制（1） PBS：配方一-用电子天平
3、准确称取NaCl /8.0 g，KCl /0.2 g，KH2P04/ 0.29 g，Na2HP04-12H20/ 1.42 g溶于800 mL的超纯水中，用玻璃棒搅拌至溶解后调节pH值为7.27.4，然后定容至1L。置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4冰箱冷藏备用。配方二-等渗0.01MPBS（1X PBS）细胞培养用，用电子天平准确称取NaCl/8.00g浓度为8/58.5=0.13675M，本配方主要靠NaCl，KCl/0.20g浓度为0.2/74.5=0.00268M，Na2HPO412H2O/2.90g浓度为2.90/358= 0.0081M，Na2HPO42H2O/
4、1.44g浓度为2.90/358= 0.0081M，KH2PO4/0.24g浓度为0.25/136= 0.0019M，溶于800 mL的dddH2O，用玻璃棒搅拌至溶解，dddH2O定容至1000ml。置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4冰箱冷藏备用。配方三-用电子天平准确称取NaCl /8.0 g，KCl /0.2 g，KH2P04/ 0.2g，Na2HPO4-7H20/2.16 g，MgCL26H2O/0.1g，CaCL2/0.1g溶于800 mL的超纯水中，用玻璃棒搅拌至溶解后调节pH值为7.27.4，然后定容至1L。置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于
5、4冰箱冷藏备用。（2） 0.25%胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶粉末（1：250）0.25g，用PBS在容量瓶中定容至100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于20保存。（3） 0.25胰蛋白酶-0.02EDTA消化液：准确称取0.25g的Trypsin和0.02g的EDTA，用PBS在容量瓶中定容至100ml，调节pH值为，用孔径为0.22m的滤膜过滤除菌，用2mL的离心管分装，冻存于-20冰箱备用。（4） 培养基：基础培养基MEM，这是使用最为广泛的培养基；完全培养基配置方法为：1L MEM基础培养基添加4.76gHEPES充分溶解后，用NaOH將PH调到7.4，加2ng/ml bFGF，
6、20%小牛血清，1mmol/L的L-谷氨酸，50mmol/L的2-巯基乙醇，100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素。（5） HEPES溶液：配置100贮存液（1mol/L），在99ml培养液中加入1ml贮存液，使最终浓度任为10mmol/L。100贮存液（1mol/L）配置方法：取23.8gHEPES溶于90ml双蒸水中，用1mol/L NaOH调PH至7.58.0，然后用水定容至100ml，过滤除菌，分装2ml小瓶，4或-20保存。三、 培养室的灭菌（1） 室内灭菌：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用新洁尔灭擦拭。（2） 生化培养箱灭菌：先用3新洁尔灭擦拭，然
7、后用70酒精擦拭，再用紫外灯照射。保持培养箱内空气干净，定期消毒。定期更换蒸馏水。（3） 实验前灭菌：打开紫外灯20-30分钟。（4） 实验后灭菌：用70酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台，打开紫外线照射20-30min。四、 实验人员的无菌准备：（1） 肥皂洗手。（2） 穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、穿好鞋套。（3） 戴乳胶手套，75酒精擦手。五、 无菌操作（1） 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用70酒精擦拭瓶子的外表面。（2） 靠近酒精灯火焰操作。（3） 打开和盖上盖子前后灼烧瓶颈和盖口附近。（4） 无菌级；别高的物品不能触碰无菌级别低的
8、物品。手不能从敞开的瓶口上方经过。（5） 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。（6） 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。（7） 手握试管、滴管、移液管时尽量远离工作端。（8） 尽可能移走不需要的物品，在操作中经常用酒精擦拭台面。（9） 尽可能减少开盖时间。（10） 随时擦去任何溢出物。六、 原代细胞培养方法一：组织块培养法（主要用于肌肉组织的培养）（1） 选取身体健康，无病的幼鱼，用解剖针进行头颅穿刺法杀鱼，70%酒精消毒体表，然后放在无菌的培养皿中，待用。（2） 解剖鱼体，拿入无菌操作台中，用无尘纸垫在鱼体下，用直头解剖剪剔除皮肤，取体表肌
9、肉组织，然后剥去内脏膜取肝脏组织并刮去多余的外膜，放入培养皿，用PBS清洗三遍，放入70%酒精中消毒34mim，再用PBS清洗3遍，除去血块，用加入双抗的无血清培养基清洗一遍。（3） 切割组织块，用解剖刀在培养皿上切割组织，切割过程中，加入适量的培养液保持组织湿润。（4） 悬浮移瓶，切割完成后用新鲜的培养基悬浮小组织块，用移液枪移入培养瓶中，吸弃上清液，保留少量培养液，盖上瓶盖，轻轻晃动瓶子，使组织块在瓶底均匀铺展开，用玻璃棒调整组织块使其均匀分布，组织块间隔0.5cm为宜，25cm2培养瓶中加入2030个组织块。（5） 细胞贴壁，將培养瓶在培养箱中平放2小时，使组织贴壁，然后侧放半个小时，使
10、液体浸出，然后吸出液体。（6） 细胞培养，从培养瓶边角加入3ml培养基，盖上瓶盖，满满放入培养箱中平放培养。如有悬浮，需重新贴壁。（7） 初始培养5天后换一次培养基，后期每隔2-4天换一次培养基。换培养基的时候，吸走一半旧的培养基，再加入一半新的培养基。（8） 观察、记录细胞迁出情况，适时拍照。13天内迁出较少，尽量不要观察。方法二：酶消化解离法（除肌肉和结缔组织之外）（1） 选取身体健康，无病的幼鱼，用解剖针进行头颅穿刺法杀鱼，70%酒精消毒体表，然后放在无菌的培养皿中，待用。（2） 解剖鱼体，拿入无菌操作台中，用无尘纸垫在鱼体下，用解剖剪打开腹腔（注意不能碰破肠道），剥去内脏膜取肝脏组织并
11、刮去多余的外膜，放入培养皿，用PBS清洗三遍，放入70%酒精中消毒34mim，再用PBS清洗3遍，除去血块，使肝脏呈灰白色，用加入双抗的无血清培养基清洗一遍。（3） 胰酶消化，将组织切割成1mm3大小，用1ml0.25胰蛋白酶-0.02EDTA消化液消化20min后添加3ml完全培养基终止消化，收集含有组织块的细胞悬液，以2200rpm离心2min；将所得沉淀用1ml完全培养基悬浮后接种在25cm2培养瓶中，培养温度为24。24h后添加1ml完全培养基至培养瓶。每隔7天换一次培养基。（4） 当从组织块迁移出的细胞停止生长时，用0.25%胰酶消化混合液消化细胞后，在原培养瓶继续培养，并在新鲜培养基中添加一半旧培养基。如此重复传代若干次，直至细胞长满培养瓶后按照常规方法以1：2比例传代。
