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1、准确称取天山云杉种子0.1g，先加入1 ml预冷的50 mmol/ L的磷酸缓冲液(pH 7.0, 内含Immol/LEDTA)，研磨成匀浆，然后用4.5ml分两次冲洗研钵至试管中，4 C，10000 r/min离心20 min，上清液即为酶提取液，4 C保存用于ROS系统酶活性分析。3酶活性的测定3.1过氧化物酶(POD，EC 1.11.1.7)活性的测定。按照Chance和Maehly6的方法，并作如下修改:反应混合液为50 mmol/ L的磷酸缓 冲液(pH 7.0，内含 0.1 mmol/ L EDTA) 2.9 mL 2 % H2O2 1.0 mL，50 mmol/ L 愈创木酚 1
2、.0 mL。测定时，反应混合液先在25 C水浴中预热，立即加入0.1 mL酶液以启动反应， 以缓冲液调零，测定OD470值，每隔30 s读数一次。取0 60 s时间段，即1 min反应 时间来计算酶活性。以每分钟OD470增加0.01的酶量为一个酶活单位，U - g-1。计算公式：POD 活性=AA470 x Vt x (0.01x t x FW x V-1注: AA470 :反应时间内吸光度的变化；Vt：酶提取液总体积:ml； V1：测定用酶提取液体积， ml； FW:样品鲜重，g； t:反应时间，1 min3.2过氧化氢酶(CAT，EC 1.11.1.6)活性的测定。按照Aebi7的方法，
3、并作如下修改：反应混合液为酶液0.2 mL (空白管以失活的酶液 代替)，50 mmol/ L的磷酸缓冲液(pH 7.0,内含0.1 mmol/ L EDTA) 1.5 ml蒸馏水1.0 ml。测定时，反应混合液和0.1 mol/ L H2O2预先在25 C水浴中预热。取反应混合液， 加入0.1 mol/ L HO20.3 ml，终体积为3 ml，测定OD24。值，每隔1 min读数一次，共读4 min。以每分钟OD240减少0.1的酶量为一个酶活单位，U - g-1。计算公式:CAT 活性=AA240 x Vt x (0.1x tx FW x V-1注：AA :A (A+ A) / 1； A
4、；对照管的吸光度；A： A :样品管的吸光度；V :酶提取 240012012t液总体积，ml； V1：测定用酶提取液体积，ml； FW:样品鲜重，g； t:反应时间，1 min 3.3超氧化物歧化酶(SOD，EC 1.15.1.1)活性的测定。按照Giannopolitis和Riesw的方法，并作如下修改:反应体系:50 mmol/ L， pH 7.8 磷酸缓冲液 3.0 ml，130 mmol/L 甲硫氨酸 0.6 ml，750 gmol/L 氮蓝四唑 0.6 ml，0.1 mmol/ L EDTA 0.6 ml酶提取液0.2 ml (对照管以失活的酶液代替)，蒸馏水1.0 ml，20皿o
5、l/ L 核黄素0.6 ml。混匀后，将一支对照管放置暗处，其他各管置于30 C光照为4000 lx日 光灯下反应20min(要求照光情况一致，视酶活性高低适当调整反应时间。至反应结束后， 用黑布遮住试管，终止反应。以避光的对照管作为空白，测定各管OD56。值。以抑制NBT光 化还原的50 %为一个酶活单位，U g-1。计算公式:SOD 活性=(A0As) x Vt x (0.5 x A0 x FW x V-1注：A。:照光对照管的吸光度；As:样品管的吸光度；Vt：酶提取液总体积，ml； V1：测定用 酶提取液体积，ml； FW:样品鲜重，g”13.4抗坏血酸过氧化物酶(APX，EC 1.1
6、1.1.11)活性的测定。按照Nakano和Asada9的方法，并作如下修改：反应混合液为50 mmol/ L磷酸缓冲 液(pH 7.0,内含 0.1 mmol/ L EDTA) 0.5 mmol/ L ASA 测定时，反应混合液和 6 mmol / L H2O2预先在25 C水浴中预热。取反应混合液2.9 ml，加入酶液50以，加入6 mmol / L2 H2O2 50以(终浓度为0.1 mmol/ L)以启动反应，终体积为3 ml，以不加H2O2作空白 调零，测定OD29值，每隔10 s读数一次。取0 30秒时间段，即30秒反应时间来计 算酶活性。以每分钟氧化1 gmol ASA的酶量为一
7、个酶活单位，U g-1 min-1。计算公式：APX 活性=AA290 x Vt x (2.8 x t x FW x V-1注：AA290 :反应时间内吸光度的变化；Vt：酶提取液总体积:ml； V1：测定用酶提取液体积， ml； 2.8: 1 mmol ASA在290nm波长的消光系数；FW:样品鲜重，g； t:反应时间，0.5min 3.5谷胱甘肽还原酶(GR，EC 1.6.4.2)活性的测定。按照Halliwell和Foyeru0的方法，并作如下修改:反应混合液为50 mmol/ L磷酸缓 冲液，（pH 7.5，内含 0.1 mmol/L EDTA），5 mmol/ LMgCl2o 测定
8、时，反应混合液、10 mmol/ LNADPH2和10 mmol/ L GSSG预先于25C水浴中预热。取反应混合液2.34 ml，加入酶 液 450 以、10 mmol/ L NADP1H 60 以（终浓度为 0 . 2 mmol/L ）及 10 mmol/ L GSSG 150 以（终浓度为0.5 mmol/ L U以启动反应，终体积为3 ml，以缓冲液代替酶液调零，测定 OD34值，每隔30 s读数一次。取0 3.5 min时间段，即3.5 min反应时间来计算酶 活性。以每分钟消耗1 gmol NADPH的酶量为一个酶活单位，Ug-1min-1。计算公式：GR 活性=AA340 x V
9、t x （6.22 x tx FW x V-1注: AA340 :反应时间内吸光度的变化；Vt：酶提取液总体积，ml； V1：测定用酶提取液体积， ml； 6.22: 1 mmol NADPH在340nm波长的消光系数；FW:样品鲜重，g； t:反应时间，3.5min 3.6谷胱甘肽过氧化物酶（GPX，EC.1.11.1.9）活性的测定。按照黄爱缨3、Flohe4,5等的方法，并作如下修改:反应体系由1.0 mmol/ L GSH 0.2 ml （含 2.5 mmol/ L NaN），酶液 0.2 ml 组成，由 37 C预热的 1.5 mmol/L H2O2 0.1ml 启动反 应，立即于3
10、7 C水浴中反应3 min后，加1.67%的偏磷酸沉淀液（含2 % EDTA-2Na, 28 % NaCl） 2 ml沉淀蛋白质，5000 r/min离心20 min，保留上清液。取上清液1 ml （空白管 加入双蒸水0.2ml和1.67%的偏磷酸沉淀液0.8 ml），加入0.32 mol/L Na2HPO4 1.25 ml及 DTNB （5,5-二硫对二硝基苯甲酸）0.25 ml，反应5 min，测。叽值。必要时也要测定样品 本身的GSH （及其他-SH）的值。以单位鲜重（g）的植物样品，在37 C下，每分钟使GSH 的改变为总量的0.001时为一个酶活性单位（扣除非酶反应的GSH），Ug-1 min-1。计算公式：GPX 活性=（A0-As） x Vt x （0.001 x A。x t x FW x V-1注：A0:照光对照管的吸光度； 样品管的吸光度；（:酶提取液总体积，ml； V1:测定用 酶提取液总体积，ml； FW:样品鲜重：g； t:反应时间，5min欢迎您的下载，资料仅供参考!致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书，学习课件等等打造全网一站式需求
