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1、名词解释，15分 问答25分 应用题，21分 图解分析，9分 计算题，30分、名词解释化学酶工程：又称初级酶工程，由酶学与化学工程技术相互结合而成，通过化学修饰、固 定化处理、甚至通过化学合成法等手段，改善酶的性质以提高催化效率及降低成本。它包括 天然的、化学修饰的、固定化酶及人工模拟酶的研究和利用。抗体酶：通过生物体免疫系统产生的，具有底物过渡态结合部位的抗体，有很高的催化活 性。酶分子侧链基团修饰：用一定方法使酶分子侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和 功能。酶的光学异构专一性：当底物具有旋光异构体时，酶只能催化L型和D型两个对映体中的 一个。酶催化的临近效应：底物与底物之间、酶的催化
2、基团与底物之间结合于同一分子，从而使反 应速率大大增加。固定化酶的分配效应：固定化载体亲水、疏水性质对底物、产物在微环境和宏观体系之间发 生的不等分配，从而改变酶反应系统组成的平衡而最终影响酶反应速度的一种效应。酶的活性中心：酶分子上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域，它包括 决定酶专一性的结合部位和酶催化性质的催化部位。盐析法：根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差别而建立的一种纯化方法。Ribozyme : any RNA molecule that acts as an enzyme。固定化酶的内扩散效应：对一有微孔载体的固定化酶，底物从固定化酶外表面扩散到微孔内 部，
3、或产物沿相反途径扩散。问答 酶和一般的化学催化剂的共性与特性 催化剂又叫触媒，根据国际纯粹与应用化学联合会的定义，催化剂是一种物质，它能够改变 反应的速率而不改变该反应的标准吉布斯自由焓变。酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，不仅作为各种复杂生物化学反应的催化 剂，催化生物体内的诸多反应，而且也作为生物体内能量转化的中间体。酶具有催化剂的共 性：1）用量少而催化效率高；2）不改变化学反应的平衡点；3）参与反应，但在反应前后 本身无变化。与化学催化剂比较，酶具有显著的特点，其中最重要的在于四个方面：1）催化反应的高效 性。极少量的催化剂就可以使大量的物质发生化学反应，而酶作为自然界中催化
4、活性最高的 一类催化剂，比普通化学催化剂的催化效率高出许多；2）催化作用的高度专一性。酶的催 化具有高度选择性，大多数酶对所作用的底物和催化反应都是高度专一的；3）酶活性可以 调控。酶活性的控制是代谢调节作用的主要方式，这种调控主要是通过酶浓度、激素、共价 修饰、抑制剂、反馈、金属离子等的调节实现的；4）反应条件温和。酶催化反应可在常温 常压下进行，而一般的化学反应需在高温、高压、强酸强碱等剧烈条件下进行。选择酶分离纯化方法的依据，如何评价分离纯化方法的可行性依据：酶的分离纯化方法一般是依据酶分子的大小，形状，电荷性质，溶解度，亲和专一性 等性质而建立起来的。评价方法有3个主要指标：1）总活力
5、的回收率，指纯化后样品的总酶活占纯化前样品总酶活的百分比。回收率越高， 说明纯化过程对酶活的影响越小，导致的酶活损失就越少。2）比活力，指在特定条件下，1mg酶蛋白所具有的酶活力单位数，是反映酶催化性能的 一个重要参数。比活力提高的倍数即纯化后样品与纯化前样品的比活力的比值，较大的提高 倍数说明纯化后酶的比活力有了显著地提高，即表明了纯化方法的有效性。3）较好的重现性，这是衡量纯化方法是否可行的必要条件，它要求操作材料有较高的稳 定性，且操作条件要易于控制。简述盐析法分离蛋白质的原理盐析法是古老的、也是目前仍广泛采用的方法，它根据酶和杂蛋白在高浓度盐溶液中溶解度 的差别而实现酶的分离纯化。水分
6、子包围在蛋白质分子表面的疏水区域，形成类似竹笼的构 造，使蛋白质分子与水环境形成隔离，当加入盐类时，由于中性盐的亲水性比蛋白质大，盐 离子在水中发生水化而使蛋白质脱去水化膜，暴露疏水区域，而后因为疏水区域的相互作用， 蛋白质间形成沉淀。另外由于蛋白质氨基酸残基在水环境中的作用，不同PH值下，蛋白质 带有不同性质的电荷，而加入的盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，可以形成 离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢，进而 聚集起来。如何控制酶的发酵生产的工艺条件酶的发酵生产工艺主要从以下几个方面着手进行：1）pH值的控制：初级调节控制（起始培养基）调整C/
7、N，调整生理酸性物质与生理碱性 物质之比；补料调节：流加酸/碱，补加碳、氮源；溶解氧调节：控制代谢中间产物的 氧化程度；添加缓冲液。2）温度的控制：不同的微生物有不同的最适生长温度，还有些微生物生长的最适温度与发 酵产酶的最适温度有所不同，为此，在有些酶的发酵生产过程中，即在微生物生长阶段控制 在生长最适温度范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度。一般采用热水升温，冷水降温。3）溶氧的控制：调节通气量；调节氧的分压：富氧增加空气压力；调节气液接 触时间：增加液位高度，增设档板；调节气液接触面积：提高搅拌速率，空气分布管及 其及直径；培养液的特性：粘度、表面张力、菌体浓度、离子浓度。4）泡沫的控制
8、：减少泡沫形成（原料，罐压，搅拌）；机械消泡与化学消泡。5）湿度的调节控制：用固体培养基生产酶制剂时，一般前期湿度低些，培养后期湿度大些， 有利于产酶。酶分子侧链基团修饰进行的几种重要修饰反应类型及修饰的反应基团酶分子侧链基团修饰反应主要分为，酰化反应，烷基化反应，氧化和还原反应，芳香环取代 反应等，被修饰的反应基团主要有，氨基，羧基，巯基，咪唑基，酚基，吲哚基，胍基，甲 硫基等。为什么要对细胞进行固定化？固定化细胞的方法主要有哪些通过各种方法将细胞与水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程，称之为细胞固定化。固 定化细胞技术相比于固定化酶技术，省去了酶的分离手续，细胞为多酶系统，无须辅因子再
9、生，且保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定，其次细胞生长快、而且多、反应快， 可以连续发酵，节约了成本，排除产物抑制和消耗。1）包埋法，将细胞包进多孔载体内，小分子的底物和产物均可自由出入，而细胞却不会漏 出。2）载体结合法（吸附、离子结合法），将细胞在适当的条件下与载体吸附或形成络合物固定 在载体上。优良的产酶微生物应当具备的条件 酶的产量高 容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性较强，便于管理 菌株遗传性要稳定，不易变异退化不易感染噬菌体，保证生产的稳定性 菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低 发酵产物利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶 菌株安全可靠，不是病原菌，不
10、产毒素及其它有害物质，不影响生产人员的身体健康 基因工程菌株必须符合安全性要求酶的固定化方法及特点载体结合法： 酶与载体之间的亲和力主要是范德华力疏水作用、氢键疏水作用； 离子结合，酶以离子键结合于固相载体上，酶活力不易丧失，结合力不高； 共价结合，酶的非必须基团通过共价键结合于固相载体上，酶活力丧失较多，结合牢固； 物理结合，酶活力不易丧失，结合力较弱；交联法：多个酶分子之间在双功能基团交联剂作用下，相互交联呈网状结构;包埋法：格子型，将酶包裹在凝胶微小格子中；微胶型，酶包裹在半透性聚合物膜中。两种方法酶本身不发生物理化学变化，活力丧失很小；固定化酶的制法及其特性比较特性制备方法物理吸附法离
11、子结合法共价键结 合法交联法包埋法无载体固 定化制法易易难难易难酶活力高高中中高高底物特 异性不变不变可能有变 化可能有变化可能有变 化可能有变 化结合能 力弱中强强弱强再生可能可能不可不可不可难固定化费用低低高高中高应用超氧化物歧化酶SOD具有抗氧化，抗衰老等作用，对红斑狼疮，结肠炎及氧中毒等疾病有 显著疗效，然而它在体内的稳定性差，在血浆中半衰期只有6min，L一天冬酰胺酶是治疗白 血病非常有用的药物，但细菌来源的酶有免疫源性。请选择一种具体修饰方法以降低抗原 性或增强其稳定性酶半衰期相对稳定性天然SOD6min1右旋糖酐一SOD7h70Ficoll（低分子量）一SOD14h140Fico
12、ll（高分子量）一SOD24h240聚乙二醇一SOD35h350聚乙二醇类修饰剂既能溶于水，又可以溶于绝大多数有机溶剂的两亲分子，且没有免疫原性 和毒性，在体内不残留，是一种优良的修饰剂。对于1-天冬酰胺酶的修饰，常采用单甲氧基 聚乙二醇MPEG均三嗪类衍生物来修饰，均三嗪环上的氯原子很活泼，容易与MPEG的羧基 发生反应，在不同条件下生成活化的MPEG1和MPEG2，这其中引入的活泼氯原子很容易与 酶中的氨基反应，实现酶的修饰，经修饰后，L-天冬酰胺酶的抗原决定簇基团与修饰剂通过 共价键相互结合，破坏了酶分子中抗原决定簇的结构，使酶分子的免疫性获得了很大的降低， 甚至是消失。同时大分子的修饰
13、剂也“遮住”了抗原决定簇，阻碍抗原和抗体的结合反应。使用聚乙二醇修饰SOD，可以使SOD分子表面赖氨酸残基（多数为抗原决定簇）上的一NH2 缩合或者掩盖，降低甚至消除了其抗原性，并且形成的修饰物无毒、半衰期长，增加了其在 生物体内的活性与稳定性。应用2分离纯化深层发酵法生产的胞内酶提示：分离技术，操作顺序，操作的原理。离心 盐析 离子交换层析 机械破碎 电泳酶的提取、分离、纯化需要经过四个阶段：细胞破碎，酶的抽提，酶的纯化，酶的浓缩。细胞破碎：获取胞内酶方法：1）机械破碎：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎，如捣碎法、研 磨法、匀浆法2）物理破碎：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的
14、外层结构破坏，而使 细胞破碎，如温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法3）化学破碎：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎，如有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween4）酶促破碎：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构 受到破坏，而达到细胞破碎，如自溶法对于微生物材料，如霉菌材料，可通过机械剪切、研磨或加细胞壁溶解酶解决；细菌， 少量材料常用超声波破碎器和溶菌酶等处理，大量材料通常采用丙酮干粉法，或采用自 溶法；酵母细胞壁厚较难对付，过去多用自溶法，现在可采用的办法有：（1）细胞壁溶 解酶处理法；盐振荡法；冷热破壁法。抽提：从发酵液中获得大
15、量的胞内酶方法：利用大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随 盐浓度的升高而增加，这一盐溶现象，一般用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0. 02-0. 5mol/L的盐溶 液用于提取.在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶摩溶液提取PH2日的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳定性较好的嗨碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水丽的有机溶剂用于提取那些与肘质结合牢固或含 的酶纯化：依据酶分子大小差异，电学、解离特性差异性质，溶解度差异，稳定性差异，亲和专 一性等性质而建立起来的。1）沉淀分离：改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出方袪原理盐析不同蛋 曰质在不同盐族度滔波中溶/W 縻不同答电点沉淀两,性电解质衣等 电点时溶解度最低 以及不 同的两,性 电解质有不同的等电点有机
