《影响转化率的因素》由会员分享，可在线阅读，更多相关《影响转化率的因素（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、影响转化率的因素 摘要：通过从载体DNA方面、重组DNA方面、受体细胞方面、转化方法及转化方法操作方面来探讨影响转化率的因素。 关键词：转化、转化率、载体、重组DNA、受体细胞、 Ca2+诱导转化法、电穿孔转化法、三亲本杂交结合转化法、PEG介导的细菌原生质体转化。 重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入细菌受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。转化的广义概念则指细菌细胞从周围介质中吸收DNA而发生基因型改变的生命现象。 转化率是指DNA分子转化受体菌获得的转化子的效率。通常有两种形式表征转化率，当待转化DNA分子数大于受体细胞数的条件下，转化子数与用于待转化处理的DNA分子数
2、或质量的比例；转化率的另一种表示形式是在受体细胞数相对于转化DNA分子数大大过量时，转化子数与用于转化处理的受体细胞的比例。 实际上转化并不限于实验室内发生，它也可以在自然状态下发生。曾在肺炎双球菌、枯草芽孢杆菌、嗜血流感杆菌中发现1 。只是在自然条件下发生转化的细菌种类较少，即使发生了转化，转化效率也较低。下面重点探讨影响转化率的因素，转化率的影响因素包括以下四个方面： 1.载体DNA方面 2.重组DNA方面 3.受体细胞方面 4.转化方法及转化方法操作方面 1.1 载体本身的性质决定了转化率的高低，不同载体转化同一受体细胞，其转化率明显不同。这根本上取决于载体的类型和其空间构象。载体的类型
3、方面：与受体细胞亲和性较强的载体进行转化时，其转化率明显比与受体细胞亲和性较低的载体高。载体的空间构象方面：与开环结构或线性结构的质粒载体相比，自然双螺旋闭环结构的质粒载体的转化率较高。此外，经体外酶切酶连操作后的载体DNA由于空间构象很难恢复，其转化率比具有超螺旋结构的载体质粒低两个数量级。 2.1 对同一受体细胞而言不同的重组DNA分子在其进行转化时转化率高低也不同。往往是：分子质量大的重组DNA分子的转化效率比分子质量小的重组DNA分子高，并且分子质量大于30kb的重组DNA是很难进行转化的。 2.2 重组DNA分子的浓度度和纯度都会对转化率产生影响。在10ng/100ul以下的浓度范围
4、内，DNA分子数越多，则转化率也越高，反之亦然。 3 受体细胞的选择对重组DNA分子的转化是很重要的一方面。当同一重组质粒DNA分子转化不同的受体细胞时转化率不同。野生型细菌细胞往往不能用作基因工程的受体细胞。这是由于野生型细菌种属存在特异性的保护系统限制与修饰系统，该系统作用的发挥分别由限制性核酸内切酶和修饰甲基化酶来完成的。当外源DNA分子进入细菌细胞时，限制系统就会产生限制作用，将来自不同生物的外源DNA分子或重组DNA分子降解破坏2。 而对于自身DNA分子则由修饰系统加以甲基化修饰，免于限制系统的限制作用3 。这将直接使转化率大大降低，所以往往通过诱变手段对野生型细菌进行遗传性状改造，
5、使之具备：限制缺陷型或遗传缺陷型或重组缺陷型或转化缺陷型或遗传互补型或感染寄生缺陷型。 3.1 具备限制系统缺陷型受体细胞对转化率的提高有利 以从大肠杆菌C600株中提取的质粒DNA转化大肠杆菌K12株为例。当开始转化时大肠杆菌K12的限制系统会切开为经自身修饰系统修饰的质粒DNA，使之不能在细胞中有效复制，因此转化率通常很低。同理，来自不同生物的外源DNA或重组DNA转化野生型大肠杆菌时也会遇到受提细胞限制系统的降解。为此应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受提细胞，以提高外源DNA分子的转化率。大肠杆菌的限制系统主要由hsdr基因编码，所以凡具有hsdr-遗传表型的大肠杆菌都丧失了降解外源D
6、NA的能力，进而外源DNA的可转化性就被提高了许多，转化效率可被提高1000倍左右。3.2 具有重组缺陷型的受体细胞对转化率的提高有利 在野生型细菌中，进入细胞的外源DNA分子能自发地与染色体DNA发生体内同源重组反应，该重组反应受rec基因家族的编码产物控制。为了提高转化率，可使recA或recB或recC或recD基因发生突变，这些基因一旦发生突变，则可使受体菌细胞内的遗传重组频率降低。因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型，其基因型分别为recA- 、recB- 、recC- ，有些受体菌株则将三个基因同时灭活，通过这样可提高转化率。3.3 受体细胞的转化亲和性对转化率的影响
7、用于基因工程的受体细胞必须对重组DNA分子具有较高的可转化性，这种特性主要表现在细胞壁和细胞膜的结构的结构上。为了提高其亲和性，可利用遗传诱变技术改变受体细胞的通透性，进而提高转化率。此外，还可选能够诱导形成感受态细胞的菌株作为受体细胞，以提高DNA分子的转化率。3.4 由于遗传互补行型受体细胞和感染缺陷型受体细胞分别和外源基因表达的转化细胞的筛选方面有关和人类及牲畜的安全方面有关，这里就不加篇幅探讨了。4 转化的方法及转化方法操作方面对转化率的影响4.1 Ca2+诱导转化法 Cohen等人成功实现的质粒DNA对大肠杆菌受体细胞的转化法，他们在此基础上建立了用CaCl2 制备大肠杆菌的常规方法
8、。该法影响到转化率高低的最大因素就是受体细胞的预处理或感受态细胞的的制备。对于Ca2+诱导的完整细胞转化而言菌龄、CaCl2 处理时间、感受态细胞的保存期及热脉冲时间均会影响到转化率的高低。其中应选用生命活动旺盛的菌体，为此须对菌种分纯活化，扩大培养，菌体应悬浮在相当于远体积含CaCl2 的无菌预冷缓冲液中，并置冰浴15分钟，4 下离心5分钟为宜，而且若用MgCl2与CaCl2共同处理大肠杆菌菌株，也可以提高DNA分子的转化效率，因为Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用。在菌体处理完后，感受态细胞应在12小时至24小时，4 存放，此时转化率最高，之后转化率急剧下降。此外，利用RbCl，MnC
9、l2，LiCl，KCl与CaCl2按不同组合方式进行多盐处理也可以获得很好的效果，但这种方法比起CaCl2单盐处理来讲则更复杂。 4.2 电穿孔转化法 电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在受体菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。电场强度，电脉冲时间和外源DNA浓度的参数均会对转化率产生影响。实验中常用增加电压强度减少电脉冲时间或减少电压强度增加电脉冲时间两种方法来处理受体菌细胞，但无论哪种方法都会影响受体细胞的存活率。研究表明，当电场强度与电脉冲时间的组合方式导致5070细菌死亡时，转化水平可达到最高。 4.3 三亲本杂交结合转化法 将具有接合转化功
10、能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合化作用，将重组质粒导入受体细胞并得以转化的方法叫三亲本杂交结合转化法。此法是基于非结合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式，尤其适宜那些难以用Ca2+诱导转化法和电穿孔转化法进行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌。辅助质粒与非接合质粒同存在于宿主细胞中时，非接合质粒会发生转移，为转化提供前提条件，因此辅助质粒是一个关键的因素，因此它的状态关系到转化率的高低。 4.4 PEG介导的细菌原生质体转化 在高渗培养基中生长至对数期的细菌，用含适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，去处细胞壁，形成原生质体，再加入含有待转化的DNA样品和聚乙二醇的等渗溶液，再通过离心去除聚乙二醇，将菌体涂布在特殊的固体培养基上，再生细胞壁，最终的到转化细胞。此法叫PEG介导的细菌原生质体转化。对于该法而言再生率的高低直接影响到转化率。再生率越高则转化率也越高，反之亦然。 影响转化率的因素综上所述，实验过程一般是希望提高转化率，此时可以结合上述四个方面来考虑。参考文献：1郜金荣、叶林柏.分子生物学M 1991,西科学出版社2、 3楼士林、杨盛昌、龙敏南、章军.基因工程M 2002,科学出版社
