蛋白质印迹样品制备

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1、蛋白质印迹（Western blot ）样品制备蛋白质印迹样品制备，包括裂解缓冲液、细胞培养物 裂解物、组织裂解物的制备以及蛋白质浓度的测定。目录 裂解缓冲液 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 制备细胞培养物裂解物 制备组织裂解物 测定蛋白质浓度 制备用于凝胶上样的样品：变性样品和天然样品，还原样品和非还原样品裂解缓冲液不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同，其中含有十二烷基硫酸钠（SDS）和其它离子 去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力，因此最有可能获得最高得率。选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。如果抗体无法识别变性 样品，抗体数据表会加以说明，这种情况下应使用不含去污剂

2、或含有相对温和的非离子去垢 剂（NP-40、Triton X-100）的裂解缓冲液。蛋白质位置及相应裂解缓冲液的选择蛋白质位置推荐缓冲液全细胞NP-40细胞质（可溶）Tris-HCl细胞质（细胞骨架结合）Tris-Triton膜结合NP-40 或 RIPA细胞核RIPA或采用细胞核结构组分实验方案*线粒体RIPA或采用线粒体结构组分实验方案*专门或主要存在于亚细胞结构位置的蛋白质在亚细胞结构组分裂解物中的富集程度高于全 细胞或组织裂解物这对于试图获取弱表达蛋白的信号非常有用青参阅我们的亚细胞组分 分离实验方案。裂解缓冲液配方:NP-40缓冲液150 mM氯化钠1.0% NP-40 （可用 Tr

3、iton X-100 替代 NP-40） 50 mM Tris, pH 8.0这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。如果担心目标蛋白不 能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用RIPA缓冲液更适合，因为其中所含的 离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。RIPA缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液） 150 mM氯化钠 1.0% NP-40 或 Triton X-100 0.5%脱氧胆酸钠* 0.1% SDS （十二烷基硫酸钠） 50 mM Tris, pH 8.0*可制备成10%的母液，避光保存。RIPA缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含NP-

4、40或Triton X-100的缓冲液的效果更好。但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因 此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢 剂（例如SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如Triton X-100）。 使用不含去垢剂的缓冲液制备细胞裂解物时需进行机械剪切操作，通常利用Dounce匀浆 器或使细胞通过注射器针头来完成此操作。这些情况下使用Tris缓冲液即可，但如前文所 述，要释放膜结合蛋白或细胞骨架结合蛋白，必须使用含有去垢剂的缓冲液。Tris-HCl缓冲液 20 mM

5、 Tris-HCl, pH 7.5Tris-Triton缓冲液（细胞骨架蛋白） 10 mM Tris, pH 7.4 100 mM NaCl 1 mM EDTA 1 mM EGTA 1% Triton X-100 10%甘油 0.1% SDS 0.5%脱氧胆酸盐以上4种缓冲液可在4 C下保存数周，分装之后可在-20 C下储存长达1年。蛋白酶和磷酸酶抑制剂一旦样品开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。始终将样品置于冰上或维持在4 C下，并且一开始就向裂解缓冲液中加入合适的抑制剂，能够显著减缓这些反应。许多供应商都提供即用型抑制剂混合物，但您也可以自行制备抑制剂混合物。抑制剂可抑制的蛋白酶

6、/在裂解缓冲液中的 母液（储存于最终浓度-20 C）磷酸酶抑肽酶胰蛋白酶、胰凝乳 蛋白酶、纤维蛋白 溶酶2 Rg/mL用水稀释至10mg/mL。不得反复 使用融化的分装试 样。亮抑酶肽溶酶体蛋白酶5-10 Rg/mL用水稀释。不得反 复使用融化的分装 试样。胃酶抑素A天冬氨酸蛋白酶1 Rg/mL用甲醇稀释至1mM。PMSF丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶1 mM用乙醇稀释。可反 复使用同一分装试 样。EDTA需要Mg2+和Mn2+的金属蛋白 酶5 mM用蒸馏水稀释至0.5 M。将pH调节 至 8.0。EGTA需要Ca2+的金属蛋白酶1 mM用蒸馏水稀释至0.5 M。将pH调节 至 8.0。氟化钠丝氨酸/

7、苏氨酸磷酸酶5-10 mM用水稀释。解冻之后不得反复使用。原机酸钠酪氨酸磷酸酶1 mM用水稀释。解冻之后不得反复使用。制备原帆酸钠所有步骤均在通风橱中进行。1. 用双蒸水制备100 mM原帆酸钠溶液。2. 用HCl将pH调节至9.0。3. 煮沸至无色。稍微盖住溶液，尽量减小由蒸发造成的体积变化。4. 冷却至室温。5. 再次将pH调节至9.0。6. 煮沸至无色。7. 重复以上循环，直到煮沸并冷却溶液之后的pH保持9.0。8. 用水补至初始体积。9. 分装之后保存于-20 C。如果样品变黄，丢弃样品。制备细胞培养物裂解物1. 将细胞培养皿置于冰上，用预冷的PBS洗涤细胞。2. 吸出PBS，然后加入

8、预冷的裂解缓冲液（每107细胞/100 mm培养皿/150cm2培养瓶加入1 mL；每5106细胞/60 mm培养皿/75 cm2培养瓶加入0.5 mL）。3. 用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微 量离心管中。或者，也可先用胰蛋白酶处理细胞并用PBS洗涤，再用裂解缓冲液在微量 离心管中悬浮细胞。4. 在4 C下以恒定速率搅拌30分钟。5. 4 C下在微型离心机中离心。您可能需要根据不同的细胞类型调整离心力和离心 时间；建议以12,000 rpm离心20分钟，但具体设置须根据您的实验确定（例如，离 心白细胞时应采用较为温和的离心设置）。6. 轻轻地从离心机中取

9、出离心管并置于冰上，吸取上清液并转移至放置在冰上的新 离心管中，弃去沉淀。制备组织裂解物1. 用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止 样品被蛋白酶降解。2. 将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf管中，并浸入液氮中进行速冻。将样 品保存在-80 C下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。3. 对于约5 mg的组组，向离心管中快速加入约300 pL预冷的裂解缓冲液，然后 用电动匀浆器进行匀浆，用另外2x 300 pL裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4 C下持 续搅拌2小时（例如，置于冰箱中的回旋振荡器上）。裂解缓冲液的体积必须根据存在 的组织数量确定。蛋白质

10、提取物不应过度稀释，避免蛋白质损失和凝胶上样体积过大。我们推荐的最低浓度为0.1 mg/mL，最佳浓度为1-5 mg/mL。4. 使用微量离心机在4 C下以12000 rpm离心20分钟。从离心机中轻轻地取出 离心管，将其置于冰上，吸出上清液并将其注入置于冰上的洁净管中。弃去沉淀。确定蛋白质浓度1. 进行Bradford分析、Lowry分析或二喹琳甲酸（BCA）分析。通常使用牛血清 蛋白（BSA）作为蛋白质标准品。2.确定每个样品的浓度之后，可将其冻存于-20 C或-80 C以备后续使用，或以备进行免疫沉淀分析或以备凝胶上样。制备用于凝胶上样的样品变性、还原样品抗体通常识别目标蛋白的一小部分(

11、被称为“表位”)，这一结构域可能位于蛋白质的三维结 构内。要使抗体能够接近该部分，必须使蛋白质展开，即使其变性。要使蛋白质变性，加入含阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)的上样缓冲液，并在95-100 C下煮沸混合物5分钟。也可在70 C下加热混合物5-10分钟，这种处理方式 适用于多次跨膜蛋白研究。煮沸处理使膜蛋白质聚集，而蛋白质聚集体无法有效进入凝胶中。标准的上样缓冲液被称为 2 Laemmli缓冲液(Laemmli UK, 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bateriopha

12、ge T4.Nature, 227, 680-5)。也可将其制备成4x和6x缓冲液，以尽量降低样品的稀释度。2x缓冲液应按照 1:1的比例与样品混合。2 Laemmli缓冲液配方 4% SDS 10% 2-巯基乙醇 20%甘油 0.004%漠酚蓝 0.125 M Tris HCl 测定pH值并将pH调整为6.8用SDS处理蛋白质时，所有蛋白质都附着在SDS阴离子上并因此带负电荷。SDS和蛋白 质以1.4:1的质量比特异性地结合，因此SDS赋予多肽的负电荷与其长度成正比。变性的 多肽变为带负电荷的“棒”，且单位长度的电荷密度相等。因此，多肽的迁移取决于多肽的分 子量，而不是多肽的固有电荷。SDS

13、的纯度对于实现高质量的蛋白质分离至关重要：如果整块凝胶的蛋白质染色背景中的 蛋白质条带模糊不清或只能勉强看清，表明所用的SDS过于陈旧或质量不佳。向缓冲液中 加入2-巯基乙醇或二硫苏糖醇能减少二硫键，这对于根据分子大小进行的蛋白质分离十分 必要。向上样缓冲液中加入甘油可增加待上样样品的密度，从而将样品维持在样品孔底部，避免样 品外溢和凝胶中上样不均匀。为了使蛋白质的迁移可见，通常要向上样缓冲液中加入小分子阴离子染料(例如漠酚蓝)。 由于染料为阴离子且分子较小，它的迁移速度比混合物中所有待分离的组分都快，因此提供 了可监测分离进程的迁移前沿。处理蛋白质样品的过程中，加热步骤前后都应涡旋混合样品，

14、以使蛋白质的分辨率达到最佳。天然、非还原样品某些抗体可识别由不连续氨基酸组成的表位。虽然组成表位的氨基酸在一级序列中相互分 离，但它们在蛋白质的折叠三维结构中相互靠近，抗体只能识别折叠结构表面上的表位。在这种情况下，必须在非变性条件下进行蛋白质印迹，数据表的应用部分将对此加以说明。一般来讲，非变性条件即不向样品和迁移缓冲液中加入SDS，并且不加热样品。某些抗体只能识别非还原形式的蛋白质（尤其是半胱氨酸残基），在这种情况下，上样缓冲 液和迁移缓冲液中不应添加&巯基乙醇和DTT。蛋白质状态凝胶条件上样缓冲液迁移缓冲液还原、变性还原且变性添加2-巯基乙醇或DTT和SDS添加SDS还原、天然还原且天然添加2-巯基乙醇或DTT和SDS不添加SDS氧化、变性非还原且变性不添加2-巯基乙醇或DTT和SDS添加SDS氧化、天然非还原且天然不添加2-巯基乙不添加SDS醇或DTT和SDS一般原则：除非数据表特别指出，蛋白质都为还原且变性状态。