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1、摘要硕士学位论文家蚕30K蛋白LP7的分离纯化及功能初探特种经济动物饲养专业硕士研究生 摘 要家蚕30K蛋白是在家蚕血液中大量表达的一类低分子量脂蛋白，也是桑蚕特有的一类蛋白质。该类蛋白由脂肪体合成，并分泌到血液中，它们是家蚕生长发育过程中的主要存储蛋白之一，也是家蚕胚胎发育的重要能源物质。30K蛋白成员众多，其氨基酸序列同源性较高，因此对这类蛋白进行分离纯化较为困难。目前，已经分离纯化出的30K蛋白只有4种。家蚕基因组框架图的完成为我们提供了大量的数据资源，利用这些数据预测到10个30K蛋白基因，这些基因所编码的氨基酸数目在246-271个之间，理论等电点在6.1-8.4之间，分子量在28-
2、31kD之间，它们的氨基酸序列同源性都在60%以上。本研究通过分析各类30K蛋白的理论等电点和分子量，设计并开展了30K蛋白的纯化工作，获得了一种新的30K蛋白，在此基础上对该蛋白进行了相关的分析和研究，主要结果如下：本研究首先参考了10个30K蛋白的理论分子量和等电点，设计了分离纯化的实验流程和实验条件。通过硫酸铵沉淀和三种层析分离技术（阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析），对家蚕血液蛋白质进行分离纯化，最终获得一种30K蛋白。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight ma
3、ss spectrometry，MALDI-TOF-MS）检测，所获得的蛋白样品信号峰单一。同时，通过MALDI-TOF-MS获得该蛋白的肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting,PMF)，利用GPMAW（General Protein/Mass Analysis for Windows）软件搜索家蚕蛋白质理论数据库，该蛋白被鉴定为30K蛋白基因Bmlp7编码的蛋白LP7，且其序列与已报道的所有30K蛋白序列均有较大差异。利用多克隆抗体制备技术，将分离纯化获得的30K蛋白LP7作为抗原，采取多次皮下注射的方法对家兔进行免疫，颈动脉放血法采集血液，获得其抗血清。通过
4、饱和硫酸铵沉淀法粗提抗血清中的抗体，去掉了大量杂质和部分杂蛋白，最后获得了抗30K蛋白LP7的抗体粗品，达到下一步实验的要求。通过Western blot技术，分别对家蚕5龄起、5龄第3天和羽化第3天的各个组织器官进行检测。结果发现，5龄起时，只在血液中检测到LP7；5龄3天时，血液中的LP7杂交信号强度明显增加，此外，在头、脂肪体和生殖腺中均检测到LP7，体壁和中肠中也有少量LP7存在，而丝腺和马氏管中没有检测到任何杂交信号。同时，分析家蚕5龄3天组织芯片数据，结果表明Bmlp7基因在头、脂肪体、体壁和生殖腺中表达，其中头的表达量最高，在丝腺和马氏管中只有微量表达，而在中肠和血液中没有表达。
5、因此，我们推测5龄第3天血液中增加的LP7蛋白是由脂肪体中合成后转移而来的；中肠的微量LP7可能从血液中转移而来；丝腺和马氏管中Bmlp7基因的表达量较低，导致蛋白水平上检测不到。对羽化第3天的组织器官进行检测，发现所有组织中均存在LP7，但此时该蛋白在雌性生殖腺中的信号强度远远高于其他组织。LP7蛋白在家蚕大量组织器官中的广泛存在，暗示该蛋白在家蚕的生长发育过程中起着非常重要的作用。同时，利用Western blot技术对家蚕部分时期的血液与生殖腺进行对比分析。发现在血液中，从5龄第3天开始检测到明显LP7杂交信号，并且随着生长发育的进行其强度逐渐增加，到化蛹第1天达到最大值，而后逐渐降低，
6、羽化第3天时杂交信号已非常微弱；而在生殖腺中，5龄第3天的LP7杂交信号非常微弱，而后逐渐增加，蛾期达到最大值。这一结果表明生殖腺中的LP7蛋白可能是由血液中转移而来，并参与了卵母细胞的形成，推测该蛋白在家蚕胚胎发育过程中起着一定作用，可能是胚胎发育的重要能源物质。检测化蛹第6天的雌雄生殖腺，结果显示雌雄生殖腺中均存在LP7，表明该蛋白在家蚕生殖发育过程中具有重要作用。进一步分析家蚕芯片时期表达谱，结果表明30K蛋白基因Bmlp7的表达量从5龄后期急速增加，吐丝前后达到最大，此后急剧下降，从上簇后的一段时间到化蛹4天，其表达又有缓慢上升的趋势，化蛹5天后表达量有所降低，到化蛾时又上升。而已有的
7、研究报道表明该基因在脂肪体中的表达只持续到化蛹第5天。因此，推测30K蛋白LP7从血液转移到生殖腺的同时，其他组织中也可能合成该蛋白。此外，利用玻璃毛细管注射器，将黑曲霉菌（一种真菌）注射到化蛹3天的蚕蛹体内，分别提取注射24h和48h后的血液，通过Western blot技术检测血液中30K蛋白LP7的变化情况。发现在注射黑曲霉菌的家蚕蛹期血液中，LP7杂交信号有微弱增强，而对照组中，LP7杂交信号趋于降低。注射黑曲霉菌后，血液中的LP7有增加的趋势，这可能是由于黑曲霉菌导致家蚕体内Bmlp7基因mRNA的表达量增加，也可能是外来物质在某种程度上阻止了血液中LP7蛋白的转移，从而导致血液中L
8、P7蛋白含量增加。这一结果暗示30K蛋白LP7可能与家蚕免疫系统相关。综上所述，本研究从家蚕血液中分离纯化到一种新的30K蛋白LP7。并制备了LP7蛋白的多克隆抗体，结合30K蛋白基因Bmlp7的芯片数据分析结果，对该蛋白的功能进行了初步研究。为进一步研究LP7蛋白以及其他30K蛋白的功能创造了条件，同时为家蚕免疫机制的研究提供了新的切入点。关键词：家蚕 30K蛋白 LP7 分离纯化 功能初探IAbstractIsolation, Purification and Functional analysis of LP7, one member of 30K family in silkworm,
9、 Bombyx moriRaising of Special Economic Animal Liu HongliSupervisor Professor Zhao Ping Supervisor Professor Xia QingyouAbstract30K proteins，a family of low molecular lipoprotein, express highly during fifth instar larvae of silkworm, which are specific lipoprotein in silkworm.They are synthesized i
10、n the fat body then secreted to hemolymph. 30K proteins are not only the main storage protein for growth, but also the important energy material of the development of embryo. Till now, the function about 30K protein is scarce and the function about physiological is not clear completely. 30K proteins
11、 have multi-members, whose comparability is so high that is difficult to separate and purify. At present, 4 members of 30K proteins have been separated and purified sucessfully. How many kinds of 30K protein need to further study. After the complete of silkworm genome, we have predicted 10 genes of
12、30K family by utilizing the database. By analysis of the data, we found that the amino acid numbers encoded by those genes are around 246-271. The theoretical pI of them are between 6.1-8.4 and the molecular weight of them are between 28kD-31kD. Whats more, the similarity of the amino acid sequences
13、 is above 60%. These information offered important reference for research of 30K protein. Based on the result, we started purification of 30K protein, obtained a novel protein, and carried on further analysis and research.Considering the difference of the molecular weight and theoretical pI of the 3
14、0K proteins, we have designed the purified experiment procedure and experiment condition of separating. By Ammonium sulfate precipitation, and three separate technologies (cation ion-exchange chromatography, anion ion-exchange chromatography and hydrophobic chromatography), we separate the proteins
15、of the hemolymph of silkworm sucessfully and got a single strip of 30K protein. By analysis using Assist matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), the single signal peak of this protein sample is obtained. It was proved that we had been succeeded in
16、 getting a single member of 30K protein in this research. Meanwhile, we got the PMF(peptide mass fingerprint map) of this protein and utilized GPMAW(General Protein/Mass Analysis for Windows) software to analyze in the silkworm protein database. We found that this protein is encoded by 30K gene Bmlp7.Compared the amino acid sequences of this protein with 30K protein reported, We found this protein is a new p
