《人民医院基因扩增实验室ABI7500实时荧光定PCR仪操作维护及校准操作规程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人民医院基因扩增实验室ABI7500实时荧光定PCR仪操作维护及校准操作规程（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1 人民医院基因扩增实验室ABI7500实时荧光定量PCR仪操作、维护及校准操作规程ABI7500实时荧光定量PCR仪概述7500型荧光定量PCR仪是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。7500型将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可实时定量观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物的情况。PCR实验结束后即刻得到定量结果，无需凝胶电泳分析，无需纯化PCR产物，无需进行任何实验操作。7500型实时荧光定量PCR仪具有节省时间，灵敏度高，准确性好和避免产物污染等优点。主要技术参数样品孔数：96孔样品基座，温度范围：4.0-99.9C温度显示：经计算机计算的实际样品温度，精确到0
2、.1C加热冷却速度：平均温度变化速度1C/秒2 温度准确性：正负0.25C,35-100C范围升降温重现性：任意温度达到时间误差小于5秒操作说明3.1实验程序运行：电源;3.1.2双击桌面上的7500快捷方式，1进入以下界面:3.1.3点击一，进入以下操作界面，按照默认设置，直接点击完成”（Finish）:3.1.4在96孔板中选择所放置样本对应的区域，如下图:3.1.5点击按钮，在弹出的对话框中选择FAM-TAMRA荧光-淬灭基团，点击“AddIpj7500Sys,LeriiSDSSuftwcirt-Phtel(AbyulutcQudriliriLdtiun)-nxlFileViBwTgiD
3、kInstrumBntAnalysisWindowHelp|i5|X|1口田|腿穹/SeirupYIn5trmnen.tyRe2ltr/Plate121345Ta1101112ftDCDEFCaDisccmectEidNUM4ToPlateDocument”:3.1.6如图所示，在弹出的对话框中勾选FAM,内参荧光选择，点击Close”:21TaskUrJinov3.1.7在，*选项下，逐个双击所选样本，设置样本类型和标准点定量值1妝Quiltity|Standard|75D00LiWellInspectorWsll(s)：C3-C6,B3-D8SamplebT自m饉：Um世actorRejo
4、rtezQuencheTTaskQuantityColorFFAMwtTAMRAUiiknoWTiNEDEOXSYERTAHKk厂OmitttellTEX胳HID肛AddDetector.t.1Removeq1oeROXJ3.1.8点击】选项，按照试剂盒说明书设置相应的扩增程序:-IDIx|SJfSOOSystemSD5Software-Plate1(Ab-soluteQuantification)US3孕鸟國固園*騰童/SEtdiiYIn吕1疋11巴111:ReEultE,ThtrnalFrofil*|AutoIncranent|RampRate|G-iFUps;1I0UU/2：DO/Add
5、Cycla-SettinE15:00Q400:10|M.OQ.QAddHflldAddStpAddDimtpqii吟SamjplVolume(丛RnnMdIsUndarTrOReadyDisconnected|CAPNUM3.1.9点击按钮，为使用结果文件设定保存路径和名称。3.1.10点击“Start”开始运行扩增程序。2.2 实验结果分析：点击M按钮，打开使用结果文件;3.2.2YResult：选项，进入结果分析操作界面。点击下面的选项，双击纵坐标，选择Linear项，调整为线性坐标，点击“OK确定:Y-AxisPAutoScalef*LinearMinimum:|MB-100000Max
6、imum:吟13.2.3 选取所有样本，手动设定阈值为最大荧光值的5%左右为宜。（设定原则：改过所有阴性，使标准曲线相关系数尽可能接近1）。pHelp1t193921101121IfirMl|右fT：；叮I1i!-pi!卅.谥JUw.卩皑曽如他L(4血13斗l引*巴Fnc匚上3.2.4点击,rLir11，nrVl1选项，看相关系数是否0.98，线性是否良好。，点击Analyze进行定量分析。103MaxiualCtThreshold:|30133.33广Autof*ManualFaEelinEAzilyzeliirilTiiSjmlUFi.C牡”!-ql!l!lM-AnalysieSettin
7、gsLAutoCtnVMIkc气LIr1k?ritFiri-IOIX|7500SD5SofFware-ZOOTOBnJbv.fanahiZ(AhmlutpeQuantifiratinn)U日昌鸟國固圍|T/Pl;a1：B丫Spisctzra.匚口闻口口色仇七丫Anplific:a土ionPl口t:丫$七andarciQurvieDigociation只占卩0工土rReady&t日门dmnjCurveHetectoiFAflSI盯豐：-3.4Ctrl+HDisplayZZ1WellCtrl+M.QuantityDeltagn3 维护保养仪器每次使用完毕均需做好清洁工作；若加热模块内有脏污，可先用
8、肥皂水擦洗，然后用双蒸水擦洗，最后设定仪器90C、5分钟，使内水份蒸发干即可；4.1 仪器不使用时盖子要盖好，以免灰尘落进仪器内；4.2 透镜的清洁：在反应舱上壁有一个透镜，仪器使用过程中透镜上有可能沾上灰尘、水份，影响实验结果，可用洒精棉球擦拭透镜；卤素灯的更换：灯泡使用超过2000小时后，当测试波长下的荧光强度减弱，曲线呈锯齿状进而影响检测结果的可靠性时，必须更换卤素灯。可由技术主管或厂家工程师更换，更换方法见仪器UserGuide8-25至8-27更换后应请厂方对仪器作一次校正。4 校准每年常规由厂方对该仪器作一次校准。调准ROI参照条在仪器更换卤素灯、仪器定期校准或仪器维修后进行。不得
9、由一般实验人员进行该项操作。校正后，要进行一次质控、空白试剂的实验，并对实验结果进行评价，并做好记录。5.1 执行目标区（ROI）校正5.1.1 在ROIInspector（ROI检查器）对话框中：a.在ExposureTime（曝光时间）字段中，输入2048。b.选择FilterA（滤光器A）。5.1.2 单击瞬像：软件中用反应孔中的红色表示图像饱和。5.1.3 单击生成校正5.1.4 SDS成功生成校正图像，验证以下各项：报告的像素密度不超过750；报告的发现反应孔数为96；在ROI图像上每个反应孔区的周围显示绿色圆圈。5.1.5 单击保存校正5.1.6 为剩余的滤光器重复步骤1-5。5.
10、1.7 从7500扩增仪上取下ROI校正反应板，单击done关闭ROIInspector。5.1.8 在SDS软件中选择file宀close。当提示保存反应板文件时，单击NO。5.2执行背景校正5.2.1 准备背景反应板5.2.2 创建背景校正反应板文件：filetnew宀newdocumentwizardfilesave5.2.3 运行背景反应板：按压托盘以打开它，将背景反应板装入反应板架，关闭托盘，在SDS软件中单击Instrumenttstart5.2.4 分析背景数据：程序运行完毕单击OK，取出背景反应板放入其包装冷冻柜储存。单击analysisTxtractBackgroundtOK
11、。在反应板文件中选择resulttspectra选择反应板文件的所有反应孔，查看原始数据中是否有超过72,000，荧光标准单位（FSU）的异常光谱峰值。5.2.5 选择fileTclose5.3执行纯荧光校正5.3.1 准备纯荧光校正反应板5.3.2 创建纯荧光校正反应板文件：fileTnewTnewdocumentwizardTfinish5.3.3 运行纯荧光校正反应板：在PureSpectraCalibrationManager（纯荧光校正管理器）中：a.在DyeList（荧光列表）字段中，选择一种要校正的纯荧光。b.单击校正c.当提示您断开反应板文件连接时，单击（是）。5.3.4 将纯
12、荧光反应板装入反应板架，在提示您装入反应板文件的对话框中，单击（是）并等待程序运行并完成（约需8分钟）。在SDS软件执行纯荧光校正期间，将会锁定PureSpectraCalibrationManager（纯荧光校正管理器）窗口中的各种控制。5.3.5 程序完成取出反应板，单击下一荧光，重复1-5步骤执行CY-3、CY-5和TEXASRED纯荧光的校正程序。5.3.6 所有荧光校正结束后，单击finish。5.3.7 提取纯荧光数据：在反应板文件中选择resulttspectra,选择反应板文件的所有反应孔，analysisTExtractPureSpectraTOK5.3.8 使用下表作参考,
13、验证在正确的滤光器上出现纯荧光的光谱峰值。5.3.9 选择filetclose,SDS软件显示下一个纯荧光反应板的反应板文件，重复5.3.7-5.3.9步骤以提取剩余纯荧光的校正数据。5.3.10 当完成剩余荧光的纯荧光校正程序后,关闭剩余的反应板文件。5 相关表格扩增仪保养维护记录表,编号PCR（N）-SOP-201-01。7300/7500PCR仪支持的纯荧光比谱数据仪器纯荧光滤光器峰值(inn)FAM52OnniwajuUXCII/Milwcnxxti逊iiAX0HXCOIIiACOe55OnmNED55OnmROX610nm7300和7500PCR仪WJUIWXIl900l1JOOOIKD0
