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1、CAT酶活测定材料：（1） 0.1mol/l pH7.8 的 PBS 缓冲液（2）2000ppm申嗪霉素母液（3）2000ppm链霉素母液（4）丙酮（5）NB培养基（6）石英砂（7）研钵（8）建成过氧化氢酶测试试剂盒（9）Bradford定量试剂盒实验步骤：1、菌体活化。挑取zj173单菌落至30ml NB培养基中，28C摇培28h。按1:100的接菌量，吸 取2ml菌液至200mlNB培养基中，28C扩培12h，至OD值为0.1-0.2。2、药剂处理。分别加入800p l上述申嗪霉素母液和链霉素母液，药剂终浓度为8ppm，加入800 M L丙酮作为对照处理。分别摇培1h、2h、4h、8h，待
2、用。3、收集菌体。将上述不同处理的菌液转移至250ml离心管中，6000rpm 4。离心10min。4、酶液制备。将上述菌体沉淀放入研钵中，加入少量石英砂，液氮研磨至菌体变白。用0.1mol/lpH7.8的PBS缓冲液重悬，8000rpm 4。离心10min，上清液即为酶提取液，置于0C保 存。5、蛋白定量。操作步骤参照Bradford定量试剂盒说明书。Bradford Reagent在使用前先预热到 室温，上下颠倒数次混匀。预热酶标仪，取4gl蛋白标准品加0.01M PBS稀释至100pl，使终浓 度为200gg/ml。将稀释后的标准品按0，1，2, 4, 6, 8, 10，15gl分别加到
3、96孔板中，加PBS 补足到20gl，每孔蛋白含量分别为：0，0.2, 0.4, 0.8，1.2，1.6, 2，3昭。加2p L体积样品到 96孔板的样品孔中，加PBS到20pl,各孔加入200plBradford Reagent,混匀，室温放置5分钟。 用预热的酶标仪测定A595,绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。6、CAT酶活测定。CAT酶活测定方法使用建成CAT测试盒，按照下表加入试剂:对照管测定管酶提取液（M l）100试剂一（ml）0.50.5试剂二（M l）5050混匀，37C准确反应1min （60s）试剂三（ml）0.50.5试剂四（M l）5050酶提取液（M l）1006
4、、将上述待测管混匀，各孔加入200m l待测液至96孔板中，0.5cm光径，405nm处，测各管 吸光度。7、结果计算。本研究计算的是每毫克水稻白叶枯病菌菌体蛋白每秒分解1M mol的H2O2的量为 一个活力单位（U）。计算公式：菌体蛋白中CAT活力（U/mg）=（对照OD值-测定OD值）X271*：60：取样量（mL）:待测样本蛋白浓度（mg/ml）注：271为斜率的倒数SOD酶活测定材料：（1） 0.1mol/l pH7.8 的 PBS 缓冲液（2）2000ppm申嗪霉素母液（3）2000ppm链霉素母液（4）丙酮（5）NB培养基（6）石英砂（7）研钵（8）建成超氧化物歧化酶测试试剂盒（9
5、）Bradford定量试剂盒实验步骤：2、菌体活化。挑取zj173单菌落至30ml NB培养基中，28C摇培28h。按1:100的接菌量，吸 取2ml菌液至200mlNB培养基中，28C扩培12h，至OD值为0.1-0.2。7、药剂处理。分别加入800p l上述申嗪霉素母液和链霉素母液，药剂终浓度为8ppm，加入800 M L丙酮作为对照处理。分别摇培1h、2h、4h、8h，待用。8、收集菌体。将上述不同处理的菌液转移至250ml离心管中，6000rpm 4。离心10min。9、酶液制备。将上述菌体沉淀放入研钵中，加入少量石英砂，液氮研磨至菌体变白。用0.1mol/lpH7.8的PBS缓冲液重
6、悬，8000rpm 4。离心10min，上清液即为酶提取液，置于0C保 存。10、蛋白定量。操作步骤参照Bradford定量试剂盒说明书。Bradford Reagent在使用前先预热到 室温，上下颠倒数次混匀。预热酶标仪，取4gl蛋白标准品加0.01M PBS稀释至100pl，使终浓 度为200gg/ml。将稀释后的标准品按0，1，2, 4, 6, 8, 10，15gl分别加到96孔板中，加PBS 补足到20gl，每孔蛋白含量分别为：0，0.2, 0.4, 0.8，1.2，1.6, 2，3昭。加2p L体积样品到 96孔板的样品孔中，加PBS到20pl,各孔加入200plBradford R
7、eagent,混匀，室温放置5分钟。 用预热的酶标仪测定A595,绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。11、SOD酶活测定。CAT酶活测定方法使用建成SOD测试盒，按照下表加入试剂:对照管测定管试剂一应用液（ml）0.50.5双蒸水（M l）50样品（m l）50试剂二（M l）5050试剂三（ml）0.50.5试剂四应用液（M l）5050用涡旋仪充分混匀，置37C恒温水浴40min显色剂（ml）1.01.08、将上述待测管混匀，静置10min，各孔加入200m l待测液至96孔板中，1cm光径，550nm 处，测各管吸光度。9、结果计算。本研究计算的是每毫克水稻白叶枯病菌菌体蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达 50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。计算公式：菌体蛋白中总SOD活力（U/mg）=（对照OD值-测定OD值）/对照OD值：50%X反应液 总体积（ml）：取样量（mL）：待测样本蛋白浓度（mg/ml）
