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1、单选，25分名解，5个，10分简答，论述，65分一、 名解1. 原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。细胞独立生存性差。2. 传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。这一过程称为传代。否则将影响细胞的继续生存。3. 克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。4. 细胞系（cell line)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。5. 无限细胞系： 细胞获永久性增殖能力。核型大多变成异倍体。6.
2、 克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群.7. 细胞分裂指数（Mitotic Index, MI)：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.8. 细胞相互接触能抑制细胞运动，这种现象称为接触抑制(contact inhibition)。9. 饲细胞(Feeder cells)： 也称为滋养细胞，用成纤维细胞或其它细胞长成单层后，用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力，但能存活和有代谢活动。将其作为底物，其它细胞接种上面；饲细胞的代谢产物也有利于其它细胞生长。饲细胞用于：特殊难培养细胞，注意避免用同源细胞。二、 大题1血清的主要作用（1）提
3、供细胞生存、生长和增殖所必需的生长调节因子。（2）补充培养液中没有或量不足的营养成分。（3）含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上。（4）提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。（5）有中和毒性物质保护细胞不受伤害。（6）提供蛋白酶抑制剂，保护细胞不受死细胞释放的蛋白酶的损害。2如何提高体外培养细胞的成活率 成功的关键:培养物必须贴附在底物上 细胞生长和增殖（1）组织和细胞的供体年龄（2）培养条件：合理的培养基，血清，胰岛素（3）贴附底物(4) 培养方法：酶消化分离，注意浓度以及消化时间 3培养用液有哪些？ （1）平衡盐溶液 （2）天然培养基（3）合成培养基 （4）消化液 （5）pH
4、调整液：NaHCO3 溶液、HEPES（分子量238.31）溶液 (6) 抗生素溶液 4以心肌细胞（神经元）为例，描述培养细胞的整个过程？ （一）取材（二）组织的分离1、将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡23秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。2、用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入56倍的0.25%胰酶液，37中消化2040分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，
5、使细胞分离5、加入35ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。6、静置510分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。8、加入Hanks液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。9、加入培养液l2 ml（视细胞量），血球计数板计数。10、将细胞调整到5105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37下培养。大鼠大脑皮层神经组织细胞培养组织来源新生大鼠1-2日龄，碘 酒 ，洒精消毒。取出大脑，分离脑 膜 ，夹取两侧大脑皮质放入接种培养液中，用D-Hanks冲洗二遍。剪碎，0.5-1mm3,用D-Hanks充分洗去残血加入5-10倍量
6、0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水37浴箱中消化20-25分钟。终止消化离心洗涤 1000转/分 ，5分钟弃上清。吹打制成细胞悬液。台盼兰染色计数后接种于事先涂好多聚赖氨酸培养板中。37 5%CO2培养2天后换生长培养液 5细胞冻存过程？冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在4冰箱中放置 3060 分钟；然后转入-20，放置30 分钟；然后再转入-80放置1618 小时（或过夜）；最后放入液氮中长期保存。6 2-巯基乙醇的作用在杂交瘤技术中，常在DMEM培养基中加入2-巯基乙醇（2-Me). 2-Me对细胞的生长有非常重要的作用，（1）能诱导细胞增殖；（2）避免过氧化物对培养细胞的损害；7
7、 胰蛋白酶溶液特点？胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系。一般来讲，胰酶浓度大、作用温度高、作用时间长，对细胞分离能力也大，但超过一定的限度会损伤细胞。胰酶溶液在pH8.0，温度为37时，作用能力最强（但是是在ph7.2时使用，无Ca2+、Mg2+用）。注意：钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks 平衡盐溶液配制成0.25%溶液。三、 选择1培养细胞生存环境，温度：人哺乳动物：36.50.5;鸟类：38.5; 一般培养细胞对低温的耐受力比高温强温度上升不超过39
8、时,细胞代谢强度与温度成正比。39401小时,受损伤的细胞可能恢复；41421小时,严重损伤,个别细胞恢复；43以上1小时，细胞全部死亡。温度不低于0时,细胞代谢有影响,无伤害作用;置于 2535，细胞能生存，但生长速度减慢；放在 4 数小时,再放回 37 细胞仍继续生长。细胞代谢随温度降低而缓慢，温度降至冰点以下时,细胞因胞质结冰受损而死亡。2 所有细胞都需要谷胺酰胺，其特殊的作用,可促进各种氨基酸进入细胞膜。所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；是合成3，2和一磷酸腺苷时所需物;是能源和碳的来源。如没有谷胺酰胺细胞生长不良而发生细胞死亡。所以要求各种培养液中都含有较大量的谷胺酰胺。谷胺酰胺在溶
9、液中不稳定，应放置在20冰箱保存，用前加入培养液内。已含谷胺酰胺的培养液在4冰箱内可放置两周以上时重新加入原来量的谷胺酰胺。3 天然培养基： 用人或动物血清、血浆和胎汁等。常用牛血清。血清含有多种促生长因子、贴附因子及其它活性物质等。加入5血清：维持细胞不死或缓慢生长；加入1020血清：细胞增殖生长。4 消毒方法分为三类：物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤、过滤等），化学灭菌法（各种化学消毒剂）和抗生素。（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外线灯应距地面不超过2.5 米，且消毒物
10、品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。（2）温热消毒：即高压蒸气消毒，温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。常用物品消毒压力及时间：培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121, 15 磅, 20 分钟；布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干；（3）干热消毒：玻璃瓶，干热灭菌170, 4 小时（4）滤过消毒：培养液消毒（4）化学消毒
11、法：最常见的是70%酒精及1的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。5 细胞冻存（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。（3）细胞浓度控制在：11075107/ml。（4）使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下，用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20。（5）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为510。但是，有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO 能诱导
12、HL-60 细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。特别注意：（1）细胞在冷冻过程中在-20冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20这一步骤直接放入-80冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。（2）DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。（3）DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4保存。避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜。6 细胞解冻与复苏冷冻保存细胞的解冻与复苏要点：（1）快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后，应立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。（2）解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱，不仅解冻速度要快，而且动作要轻。一般情况下，解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养（1ml 冻存细胞液加入到2530ml 新鲜完全培养液中），24 小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液，以去除DMSO。如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，那么，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。
