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1、-非灭菌产品微生物检查：微生物计数法ICH概述本检查法可用于好氧的嗜温细菌和真菌的计数。当本检查法用于确定非规定灭菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物限度标准时，按以下规定进展检验，包括其取样量和结果判断等。本检查法不适用于以活菌作为活性成分的制剂的微生物限度检查。本检查法可采用替代的微生物计数方法，包括自动测定方法，但必须验证替代方法优于或与药典方法相当。一般程序本检查应在严格防止外来微生物污染供试品的实验条件下进展，防止微生物污染的措施不得影响供试品中污染微生物的检出如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时，如果使用了灭活剂，应对其有效性及对微生物的无毒性进展验证。如果在
2、供试液制备时使用了外表活性剂，应验证其对微生物无毒性及与灭活剂的相容性。计数方法检查时可采用薄膜过滤法或以下平板计数法中的一种。最大可能数法Most-Probabl -Number, MPN用于微生物计数其准确度较低，但当供试品的微生物污染程度极低时，MPN法可能是最适宜的方法。检查时根据供试品的特性和其微生物限度标准选择计数方法。该方法应满足所用的供试品检验量足以符合试验结果的判断。供试品计数方法的适用性必须确定。培养基促生长试验验和计数方法适用性确定试验总则供试品中污染的微生物计数方法的适用性应进展确认。假设检验程序或供试品发生变化可能影响检验结果时，计数方法的适用性应重新进展确认。菌液制
3、备试验菌液可用标准稳定的菌悬液商品化或按以下规定程序制备。试验菌应采用适宜的保存技术保存，试验所用的菌株传代次数不得超过5代从菌种保存中心获得的菌种为第0代。各试验菌株的培养及接种量见表1。使用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或者pH7.2磷酸盐缓冲液制备菌悬液，黑曲霉孢子悬液可用含0.05v/v聚山梨酯80的缓冲液。菌悬液应在2小时使用，假设保存在28的菌悬液可以在24小时使用。相对体积的黑曲霉和枯草芽孢杆菌的稳定孢子悬液可替代新鲜的孢子悬液，稳定孢子悬液可保存在28，并在验证过的贮存期使用。表1 实验用菌液的制备和使用培养基促生长实验计数方法适用性实验实验菌株菌液制备需氧菌总数测定霉菌及
4、酵母菌总数测定需氧菌总数测定霉菌及酵母菌总数测定金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26 003胰酪胨大豆琼脂或胰酪胨大豆肉汤，3035培养1824小时胰酪胨大豆琼脂和胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天胰酪胨大豆琼脂/MPN胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10104胰酪胨大豆琼脂或胰酪胨大豆肉汤，3035培养1824小时胰酪胨大豆琼脂和胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天胰酪胨大豆琼脂/MPN胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天枯草芽孢杆菌(Bacillus s
5、ubtilis)CMCCB63501胰酪胨大豆琼脂或胰酪胨大豆肉汤，3035培养1824小时胰酪胨大豆琼脂和胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天胰酪胨大豆琼脂/MPN胰酪胨大豆肉汤100cfu3035，3天白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤，2025培养23天胰酪胨大豆琼脂100cfu3035，5天沙氏葡萄糖琼脂100cfu2025，5天胰酪胨大豆琼脂100cfu3035，5天不采用MPN法沙氏葡萄糖琼脂100cfu2025，5天黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98 003沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄
6、糖琼脂，2025培养57天，或直到大量孢子产生胰酪胨大豆琼脂100cfu3035，5天沙氏葡萄糖琼脂100cfu2025，5天胰酪胨大豆琼脂100cfu3035，5天不采用MPN法沙氏葡萄糖琼脂100cfu2025，5天阴性对照试验为确认实验条件是否符合要求，应设立阴性对照组，以稀释剂代替供试品， 阴性对照组应无菌生长。培养基促生长实验每批成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基应进展培养基促生长试验。接种如表1所示的少量微生物100cfu至胰酪胨大豆肉汤管或胰酪胨大豆琼脂平板，每一批培养基分别制备一管/皿；接种如表1所示的少量微生物100cfu至沙氏葡萄糖琼脂平板，每一批培养基分别
7、制备一皿，按表1所列条件培养。对于固体培养基，从被测试培养基获得的菌落数不得大于或小于来自验证过的标准培养基菌落数的2倍，并且其新鲜培养物的菌落形态应与之前验证过的标准培养基上的菌落形态一致；对于液体培养基，被测试培养基管出现清晰可见微生物的时间和形态应与之前验证过的标准培养基管一致。计数方法实用性实验供试液制备根据供试液供试品的理化特性选择供试液制备方法，假设以下制备方法经确认均不适宜，应采用适宜的替代方法。水溶性产品：取规定量，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲液或胰酪胨大豆肉汤培养基溶解或稀释，一般制成110供试液。如果需要，调节供试液pH值至68。必要时，用同一
8、稀释液将供试液进一步稀释。水不溶性非油酯类产品：取规定量，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲液或胰酪胨大豆肉汤培养基10倍混悬。分散能力较差的供试品，可在稀释剂中参加外表活性剂助悬，如0.1%(g/v)的聚山梨酯80。如果需要，调节供试液pH值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步稀释。油酯类产品：取规定量，溶解于经过滤除菌的无菌十四烷酸异丙酯中，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性无菌外表活性剂充分混合，必要时可采用加热的试剂帮助溶解，温度一般不超过40，特殊情况下最多不超过45，假设需要乳化可在水浴中进展，然后参加预热的稀释剂使成110供试
9、液，保持温度，小心混合，并在最短时间形成乳液状。必要时，用含适宜浓度的无菌聚山梨酯80或其他非抑制性无菌外表活性剂的稀释剂进一步10倍系列稀释。气雾剂：取规定容器数，从每一供试品容器中取全量或一定量样品无菌转移至薄膜过滤器过滤或无菌容器中进一步取样检查。贴剂：取规定数量贴剂，去除贴剂的保护层，放置在无菌培养皿或塑料皿中，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料如无菌纱布覆盖贴剂的粘贴面以防止贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂如聚山梨酯80或卵磷脂的稀释剂中，剧烈振摇至少30分钟。接种和稀释取上述制备的供试液，接入含不超过100cfu的实验菌悬液，所加的菌悬液的体积应不超过供试液体积的1。
10、同时用稀释剂做对照组。为证明样品中的微生物能被充分检出，应选择最低稀释级的供试液进展方法确认试验。如果由于样品的抗菌活性或溶解性较差原因导致检验方法无法确定，应进一步建立消除的方法。试验时，如果样品的抑菌作用无法防止，样品经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再参加菌悬液进一步试验。抗菌活性的去除或中和当供试液接种后，按计数方法中的要求进展培养计数，将样品组回收的微生物数量与对照组回收的微生物数量进展比拟。假设供试液中微生物生长被抑制比值小于2，应修订计数方法并进展确认试验以保证结果的有效性。方法修订可以包括以下几个方面：（1） 增加稀释剂或培养基用量；（2） 在稀释剂中参加专用或通用的中和剂；（3）
11、 采用薄膜过滤法；（4） 上述几种方法的联合使用。中和剂：中和剂可以用于中和抗菌剂的抗菌活性表2。中和剂可在稀释剂或培养基的灭菌前参加。假设使用中和剂，应确定其有效性和对微生物的毒副作用，可通过设定一组不含样品而含有中和剂的对照组进展确认。表2 常见干扰物的中和剂或中和方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛、汞制剂硫氢化钠硫化钠酚类、乙醇、醛类、吸附物稀释醛类甘氨酸季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍类化合物卵磷脂季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸聚山梨醇酯水银巯基乙酸盐水银，汞化物，醛类硫代硫酸盐EDTA镁或钙离子假设没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，则确认试验中的微生物回收失败可看成是由于供试品
12、的抗菌活性引起的，同时说明该供试品不能被试验菌污染。然而，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据应符合的限度标准，应采用使微生物能生长的更高稀释级的供试液进展方法确认试验。供试品中微生物的计数每一试验微生物应分别进展方法确认试验对每一列举的微生物分别加以测定，只对参加的试验菌进展计数。薄膜过滤法：试验所使用的薄膜过滤器的滤膜的孔径不得大于0.45m。薄膜过滤器的选择应能有效的截留微生物，同时供试品的组分对其没有影响。每一试验菌株使用一个薄膜过滤器。取上述已加菌的供试液适量相当1g供试品的量，假设供试品中菌数较高，可相应减少试验量至滤器中，立即过滤，并用适量
13、的冲洗液冲洗滤膜。假设测定总需氧菌数TAMC，转移滤膜至胰酪胨大豆琼脂培养基平板上；假设测定霉菌和酵母总数TYMC，转移滤膜至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按表1要求的温度和时间进展培养并计数。平板计数法：平板计数法每一培养基至少平行测定两个平板，以算术均值作为计数结果。浇碟法取上述经消除作用消除处理及加菌的供试液1ml，置于直径9cm的无菌平皿中，参加1520mL温度不超过45胰酪胨大豆琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基。如果使用直径更大的平皿，培养基体积应相应增加。每一试验菌应至少制备两个平板。按表1要求的温度和时间进展培养并计数。计算每一试验菌平板计数的算术平均值，并计算接种的试验菌数。外表涂抹法
14、取直径9cm的无菌平皿，参加1520mL温度不得超过45胰酪胨大豆琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，凝固，制成平板。如果使用直径更大的平皿，培养基体积应相应增加。在无菌层流台或培养箱中使制备的琼脂平板外表枯燥。取上述经消除作用消除处理及加菌的供试液不少于0.1ml接种于琼脂平板外表，用无菌玻棒涂抹使试验菌均匀分布在琼脂平板外表，每一试验菌至少接种两个琼脂平板。培养和计数同浇碟法。最大或然数法MPN：最大或然数计数法MPN精度和准确度比薄膜过滤法和平板计数法差，假设用于霉菌计数，结果是不可信的。因此，MPN法仅在总需氧菌没有适宜的测定方法时使用。假设规定使用MPN法，按如下程序进展。取上述经消除作用消
15、除处理及加菌的供试液按10倍系列稀释，制备至少连续3个稀释级的供试液，从每一稀释级的供试液中各吸取1g或1mL供试液3份分别加至3管装有910mL胰酪胨大豆肉汤培养基的试管中，假设需要可在培养基中添加聚山梨酯80等外表活性剂或抗菌剂的灭活剂。3个稀释级共接种9管培养基，培养。所有接种管在3035培养不超过3天，如果由于供试品特性使结果判断困难或不确定，可将该管培养物转接种至胰酪胨大豆肉汤培养基或胰酪胨大豆琼脂培养基，在同一温度条件下培养12天，在进展结果判断。根据生长管数从表3查对每1g或每1mL供试品中最大可能的菌落数。表3 微生物最大或然数Most-Probable-Number, MPN值每组生长管数MPN/g(mL)95%可信限每管含样品的g或mL数
