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1、荧光显微镜检测方法（以96孔板，A549贴壁细胞为例）细胞培养取对数生长期细胞，以每孔 4X1031 X105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。 药物处理（可选）客户可以根据实验需要进行各种药物处理。EdU标记1.1用细胞培养基按1000 : 1的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备适量50側EdU培养 基；注：1）EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（2h）宜采用高浓度（1050凶），长时间孵育（24h）宜采用低浓度（110側）;2）如果需配置10 pM EdU培养基，需调整为5000 : 1稀释比例；3）配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。表1 EdU培养基及染色反应液的使用
2、量参考96孔板*48孔板24孔板12孔板6孔板5.5 cm 小皿EdU培养基100 p150 P200 P300 P500 P2 mL染色反应液100 p150 P200 P300 P500 P2 mL注：1）*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜；2）悬浮细胞EdU用量依据培养体积而定。1.2每孔加入100山50 PM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；注：1）最佳孵育时间与细胞周期相关 （表2），大多数细胞系均可采用 2小时孵育时间；2）EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给（表1）；1.3 PBS清洗细胞12次，
3、每次5分钟。注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。表2 EdU孵育时间设定参考3T3HelaHEK293*细胞系人胚胎细胞酵母细胞人成纤维细胞人宫颈癌细胞人胚肾细胞系人神经细胞细胞周期30min3h18h21h25h5d孵育时间5min20min2h2h2h1d注：1)EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多；2)*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞 群体细胞周期会有所变化。表3细胞实验EdU孵育浓度及时间
4、参考PubMedIDReferenceCell lineConcentrationTime18272492Salic A, et al. PNAS . 2008NIH3T3, Hela10 nM10 N1 hr18521918Cappella P, et al. Cytometry A . 2008HL-60,A2780,U2OS110 mM30 min18996411Chehrehasa F, et al. J Neurosci Methods .2009Neurospheres120 mM24 hr19179371Limsirichaikul S, et al. Nucleic Acids
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6、5889Han W, et al. Life Sci . 2009VSMC502 hr20659708Huang C, et al. J Genet Genomics . 2010ESC502 hr21310713Hua H, et al. Nucleic Acids Res . 2011fissionyeaststrains103 hr20824490Lv L, et al. Mol Cell Biochem . 2011EJ cells504hr21248284Yang S, et al. Biol Reprod . 2011GC cells502 hr21227924Zhang YW,
7、et al. Nucleic Acids Res . 2011U2OS, HT2930 JM90 min21829621Guo T, et al. PloS One . 2011HIT-T1550 JM4hr21980430Zeng T, et al. PloS One . 2011MCF-10A25 JM2hr22012572Ding D, et al. Int Orthop . 2011C3H10T1/210gM24hr22000787Zeng W, et al. Biomaterials . 2011EPC50gM4hr21913215Xue 乙 et al. J Cell Bioche
8、m . 2011SGC790125pM24hr22016038Peng F, et al. Lasers Med Sci . 2011MSC50gM2hr21878637Li D, et al. J Biol Chem . 2011HCC50pM2hr注：如果您有采用 BrdU进行实验的经验，可以参照BrdU实验的相关参数进行 EdU实验。细胞固定化2.1每孔加入50丄细胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS）室温孵育30分钟，弃固定液； 注：1）低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时，需采用Triton X-100透化细胞以利于抗体进入细胞内。2）可采用其他方式进行细胞固定。2.
9、2每孔加入50丄2 mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育 5分钟后，弃甘氨酸溶液；注：目的是中和多聚甲醛，保证染色反应体系，当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省略此步骤；2.3每孔加入100山PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS ;2.4 （加强）每孔加入100山渗透剂（0.5% TritonX-100的PBS）脱色摇床孵育10分钟;PBS清 洗1次，5分钟。注：当实验需要进行其他抗体染色时，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性。普通细胞可以省略。Apollo染色3.1每孔加入100山的1X Apollo ?染色反应液 俵3），避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应
10、液；注：1）染色液用量与细胞量相关，以覆盖细胞为宜（表1）；2）孵育时间可以进行适当调整，调整范围为1030分钟。表4 Apollo ?染色反应液的配置参考（现用现配）配制顺序Apollo ?染色反应液500 g_*1 mL5 mL10 mL1去离子水469 pL938丄4.69 mL9.38 mL2Apollo?反应缓冲液（试剂B）25丄50 pL250 pL500 pL3Apollo?催化剂溶液（试剂C）5此10 pL50 mL100 pL4Apollo ?荧光染料溶液（试剂D）1.5丄3 pL15 mL30 PL5Apollo?缓冲添加剂（试剂E）5 mg9 mg44 mg88 mg注：
11、1）*表示通常配制的 Apollo?反应液的体积足以进行 510个孔（96孔板）染色；2）按顺序配制适量1X Apollo ?染色反应液，以免破坏正常的反应体系（现用现配，30分钟用完）；3）试剂E为白色粉末，较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需更换；粉末较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但不应超过戈0%。3.2加入100山渗透剂（0.5% TritonX-100的PBS）脱色摇床清洗23次，每次10分钟， 弃渗透剂；3.3 （加强）每孔每次加入100止甲醇清洗12次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。 注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背
12、景。普通实验可以省略。DNA染色4.1用去离子水按100 : 1的比例稀释试剂 F,制备适量1X Hoechst33342反应液，避光保 存；4.2每孔加入100山1X Hoechst 33342 反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；4.3每孔每次加入100止PBS清洗13次；4.4客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入 100丄PBS保存待用。其他染色（自备）（可选）客户可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色（注：染料兼容性请参照表4）。图像获取及分析建议染色完成后立即进行观测；如果条件限制，请避光4 C湿润保存待测，但不应超过3天。注：调试仪器时，请将曝光时间调整为30ms左右，尽量不要1s。表5配套染料的相关波长信息C00031*Apollo ? 567550 nm565 nmCy3C00041?Apollo 643653 nm667 nmCy5C00033*Hoechst 33342350 nm461 nmDAPI注：1)*荧光显微镜宜采用 Hoechst 33342及Apollo ? 567进行DNA复制活性检测;2)激光共聚焦显微镜采用Apollo ? 567或Apollo ? 643均可。
