《琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度》由会员分享，可在线阅读，更多相关《琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度伽）|琼脂稀释法琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50C左右的定量MH琼脂中，制成 含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长 的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定， 结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。1. 培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.27.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添 加剂；其它链球菌使用含5% （V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马 血）。2. 含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀
2、释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在4550C水 浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度34mm。通常按1 ：9比例配制 药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中， 置28C冰箱可贮存5天。3. 接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1：10稀释，以多点接种器吸取制备好菌 液（约12ul）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为58mm的菌斑。 接种好后置35C孵育1620h （甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满 24h），观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽
3、门螺杆菌置微需氧环境中 孵育。4. 结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。 在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细 菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平 板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。原理:将抗菌药物配制到琼脂培养基中成：128 u g/ml、64 u g/ml、32 u g/ml 0.06 ug/ml对倍稀释的浓度系列多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点 种到琼脂表面，经35C16
4、-20小时培养肉眼观察细菌生长，以未见细菌生长平板的 最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)抗菌药物保存液的准备1估算抗菌药物最小称量琼脂稀释法最高药物浓度为128 ug/ml药物和培养基的体积比1： 14,即药物浓度将成15倍稀释，因此保存液为128ug/mlX15 = 1920 ug/ml如果1次用量为10ml ,则：抗菌药物最小称量=i920ug/ml*10ml抗菌药物的效价抗菌药物保存液的准备2抗菌药物稀释选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释, 稀释液需要量见下列公式：稀释液体积=抗菌药物实际称量*效价保存液浓度(1920ug/ml)抗菌药物保存液的准备3实际操作：先计算完成一批试验需几
5、次完成,每次用 量多少，然后可一起称量,一起稀释，然后 按每次需要量分装在试管中，贴上标签，注 明药物名称，浓度，体积数及配制日期，置 与-20C保存,备用。培养基需氧菌MH肉汤或琼脂苛氧菌嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base + 补充由子SR158链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血卡他莫拉曲属：MHA琼脂+5%脱纤维 羊血淋球菌：CC Agar Base+L53厌氧菌Wilkins chalgren anaerobe 琼脂菌液准备1生长法：无菌环取4-5个菌落大小形态一致的菌落顶部后接种于4-5mlMH肉汤内35C培养4-6小时到对数生长期，亦可过 夜培养，
6、但不允许超过18小时用肉汤/生理盐水校正至0.5麦氏管浓度1-2X108CFU/ml菌液准备2直接菌落悬浮法：从孵育了 18-24h新鲜培养物的平板上，用 无菌环取单个菌落接种于无菌肉汤/生理盐水内 校正至0.5麦氏管浓度1-2X108CFU/ml 推荐用于苛氧菌和潜在的MRS菌液准备3对绝大多数细菌来说，上述用生长法或直 接菌落悬浮法制备的0.5麦氏浊度的菌悬 液,应该再用无菌肉汤或生理盐水行1: 10 稀释，此时菌液浓度为l-2*107CFU/ml,调 整好的菌液应该在制备后的15分钟内完成 点种菌液准备4如一次实验需完成5 0株或10 0株细菌，则细 菌要编上工作序号1-50或1-100
7、,并在结果 记录纸上要 对应写上工作序号和菌种 编号配制融化的MH琼脂或适合其他苛氧菌、厌 氧菌等特殊细菌的培养基，待冷却到48- 50C,浇制药物平板。取灭菌的90nm平板12只，用记号笔在平板 底部作好“点种标记”、“药物名称”、“药物浓度”，浓度从0.06ug/nil.128u g/ml,每种浓度1只平板共12个浓度系歹寸。琼脂稀释法药敏平板的制备2取11支无菌玻璃试管(13X100mni)，每支试 管标记为：960, 480, 240, 120, 60, 30, 15, 7. 5, 3. 75, 1.875, 0. 935 u g/m,并于上述每根管子中用无菌移液管加无菌稀释液1. 5
8、ml将保存在 -2 0 C冰箱中的1920 ug/（nl浓度的抗 菌药物保存液取出融化后，用无菌移液管吸取 2. 5ml加入到128 u g/ml标记的平板内1ml 移液管内剩余的1. 5ml加入到960标记的试管内， 混匀后再吸衣2.5ml加入到3 u g/ml标记莉平敲 内lml移液管内剩余的1. 5ml再加入到480 u g/ml标记 的玻璃试管内；混匀后再吸取2. 5ml依次类推,直至最后一个0.06 u g/ml标记的平皿 内加入lml,则抗商药物稀释完成琼脂稀释法药敏平板的制备4准备2只无药的平板，作点种前和点种后质 控对照所有药物平板应保持表面干燥，不可有肉 眼可见的水珠（可在3
9、5 C孵箱内倒置平板 开盖烘干15-20分钟）如果需使用的药物平板为100 X10(tan的方平板， 则每根玻璃管内需加入2.5m 1的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4. 5ml 每只方平板应加入2ml抗菌药物试液无菌吸管内应存留下2. 5ml与下一个浓度的玻璃 试管内的2. 5ml稀释液进行充分混匀药敏培养基应加入28ml测试菌液的点种1预先将点种针和点种板高压灭菌，并在孵箱内烘干 (52孔、100孔、或21孔)将已调整好浊度(1-2 X107CFU/ml)的菌液用微量 加样器将菌液依次加入菌液点种板小孔内，并作好 与药物苹痕相应的点种标记,一般每小孔丙应加入 菌液27
10、0 ulo每批试验均须保留有质控菌位置和 无菌菌液位置用酒精棉球清洁多点接种器后，将点种针安装在 多点接种器架子上，再将加好菌液的点种板安置 上多点接种器的点种板位置上测试菌液的点种2开启多点接种器进行点种，因每一根点种 针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点 的菌液量约为2ul,所以接种量为1(? CFU/ 点点种时应先点种对照前的质控平板，然后 从最低药物浓度开始点种依次点种到药物 浓度最高的平板药物平板的孵育上述接种好的平板应在室温下静置至接种点上的 菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒置，于 35C孵育16-20小时如葡萄球菌苯喳西林和甲氧西林，则需33-35C, 绝对不能超过35C,
11、孵育24小时，阅读结果 万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24 小时后，阅读结果淋病奈瑟球菌需在5%CO2空气环境中孵育20-24小 时，阅读结果结果阅读和判断结果阅读时，平板应置于黑色不反光的表面上， 记录的MIC是完全抑制细菌生长的最低抗生素浓度, 单个菌落或接种物所致的轻微的不清晰现象可忽 略不计。如果在MIC判断终点附近持续存在或多个菌落，或 者低浓度不长，高浓度生长；或者有俗称的跳管 现象，就应该检查试验菌的纯度，有否污染菌生 长，并尽可能重复试验。按当年的CLSI/NCCLS标准判断结果。质控菌株质控菌株药敏其他金黄色葡萄球菌ATCC29213+大肠埃希菌ATCC25922+
12、大肠埃希菌ATCC35218+产8内酰胺酶肺炎克甫伯菌ATCC700603+产超广谱F内酰胺酶钢绿假单胞菌ATOC27853+质控菌株质控菌株药敏其他肺炎链球菌ATCC49619粪肠球菌ATCC29212+检测胸腺1密晚流感嗜血杆菌ATCC49766+氨卡西林敏感株流感嗜血杆菌ATCG49247+产6内酰胺酶() 氛节西林耐药株淋病奈瑟球菌：ATCC49226+厌氧菌ATCC25285+常见问题及解决指南抗曲资现象可能原因解决办法基基糖甘关MIC太高培养基PH太低PH范围7.27.4；避 免C02孵育降低PH啖诺酮类MIC太低培养基PH太高PH 范 117.2-7.4.多种药物跳管污染、管内接种物不 正确、药物浓度错误、 肉汤休积错误重复QC试验 仗用新批号培养基
