《RNAi技术及其应用》由会员分享,可在线阅读,更多相关《RNAi技术及其应用(12页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、RNAi 技术及其应用集美大学生物工程学院 2011 级研究生 微生物专业陈丽娜学号:2011227006摘要 RNAi (RNA interference)是指外源性双链RNA(dsRNA)能抑制细胞内与其 序列同源的基因的表达1,是近年来研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术, 它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特 异性沉默(silencing)现象,其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合,使之降解,从而 阻止 mRNA 的翻译2。在进化上,这可能是生物调控基因表达及抵御病毒侵染或转座子 诱 DNA 突变的
2、一种共有的生理机制1。本文对 RNAi 技术的作用机制和应用进行了简 单的介绍。关键字 RNAi 技术 siRNA/shRNA 作用机制 应用引言RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近几年发展起来的新技术,是外源和内源性双 链 RNA 在生物体内诱导同源靶基因的 mRNA 特异性降解,导致转录后基因沉默的现象, 被Science杂志评为2001年十大科技突破之一,名列2002年十大科学之首。双链 RNA 能导致转录后基因沉默最初来自于对线虫的研究。1995 年, Guo 和 Kemphues 试 图利用反义和正义 RNA 影响秀丽新小杆线虫中 par-1 基因的表达,结
3、果意外的发现二者 同样地抑制了 par-1 基因的表达4。到 1998 年, Fire 和 Mello 在秀丽新小杆线虫中注入 dsRNA(正反链的混合物),结果发现注入dsRNA比单独注入正链或反链RNA引起基因 沉默的效率要高得多。目前, RNAi 在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等面已显示出 广阔前景。与此同时, RNA 干扰分子机制的研究也取得了飞速发展,包括对转录水平、 转录后水平、翻译水平、基因甲基化等层次的研究。清晰阐述 RNA 干扰的作用机制将 为大规模基因系统筛查、新基因的发现、人类肿瘤及难治性疾病的基因治疗提供重要理 论依据和有力工具。1 RNAi 的功能
4、21.1抗病毒功能:RNAi现象是近年来发现的一种新的调控基因表达的重要方式,但是 研究发现,RNAi是一种非常保守的方式。所有的生物在长期的进化过程中都面临着病 毒等外来生物的入侵,生物体如何使自己的基因组免受外来核酸的入侵呢?研究表明, RNAi 机制在真核细胞中起着相当于人类免疫系统的作用,充当基因的保护者。生物体 能够将外来的细菌、病毒等的核酸的RNA降解成dsRNA,将外源RNA特异地降解。1.2 基因调控:在 RNAi 发现以前,人们认为基因研究中最重要的对象是 DNA 和蛋白 质,而RNA只起到传送DNA信息的作用,甚至错误认为很多短的RNA是一些无用的 物质。但到2000 年,
5、科学家在线虫幼虫体内发现了一类由20 多个核苷酸组成的单链微 小RNA,并将其命名为miRNA。此后,科学家又发现了 miRNA调控基因的功能,但 小RNA起如此大的作用还是首次发现。在2005年1月14日发表于美国Cel 1杂志的 论文中,怀特黑德生物医学研究所的本杰明刘易斯等研究人员说,小RNA能通过阻 断蛋白质合成的方式调控基因表达。1.3染色质浓缩:内源的siRNA,一些小RNA可能通过使染色质浓缩而调节基因表达。 一些研究小组发现dsRNA结合到植物启动子区域,能通过一种使DNA甲基化的作用导 致基因沉默;在蠕虫体内检测到许多Polycom蛋白(能结合染色质),是RNAi过程所必 须
6、的;裂殖酵母中内源siRNA可介导中心粒区染色质浓缩,导致这个位点的基因转录沉 默。1.4转座子沉默:目前,两方面的证据提示转座子沉默涉及siRNA。其一,发现蠕虫 mut-7基因参与RNAi和转位抑制。其二,从裂殖酵母的中心粒区也分离出siRNA,并 检测到这些siRNA介导此区内组蛋白甲基化。由于中心粒区包含重复序列-含转座子 片段,在一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的逆转录转座子LTR(长末端重复序 列)介导的RNAi,推测在siRNA介导的中心粒区域的组蛋白甲基化可能源于古老的转座 子沉默作用。2 RNAi 作用的分子机制 5RNAi技术在众多领域都显示出巨大应用前景,RNAi机制
7、的研究也不断取得进展, 最早关于 RNAi 机制的研究集中于转录后水平,随着研究的深入,学者发现 RNAi 的作用是在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个不同水平上实现的。2.1 siRNA/shRNA 介导的转录后基因沉默转录后抑制(post transcriptional gene silencing PTGS)是指内源基因在“异常RNA”的 诱导下发生基因沉默的调控过程。被抑制的基因能够正常转录,但转录后的 mRNA 产 物会被迅速降解而失去正常功能。所以属于转录后基因沉默。这些“异常RNA”介导RNAi 的基本模式如图 1 所示。首先,dsRNA与Dicer酶在胞浆中结合并被后者切割成
8、2123nt大小的dsRNA,被称 作siRNA。SiRNA的5端是磷酸化的,3端突出2nt。其次,siRNA与核酸酶等结合形成 RNA介导的沉默复合物(RNAinduced gene silencing,RISC)。一般认为siRNA和具有 核酸内切酶活性的 Argonaute 蛋白是 RISC 的必要组成部分。最新研究又发现两个新的 RISC 组分:VIG (vasa intronic gene )蛋白和 dFXR (Fragile X related )蛋白。RISC 中 的解旋酶在ATP作用下解旋siRNA。正义链被释放,只含反义链的RISC被激活。活化 的 RISC 通过碱基互补配对
9、原则与同源的 mRNA 结合。随后蛋白的结构域发挥核酸内切 酶的功能降解mRNA,从而使目的基因沉默。图 1 siRNA/shRNA 介导的 RNAi 的分子机制2.2 siRNA/shRNA 介导的转录水平基因沉默该机制通过 siRNA 与互补的 DNA 直接发生作用,激发同源 DNA 甲基化的加强 使目的基因转录受限,表达关闭,进而基因沉默。这一现象最初是在植物中观察到的, 与启动子区内 CpG 岛同源的 siRNA 能诱导 RNA 引导的 DNA 及组蛋白 H3 赖氨酸 9 甲基化,使靶基因转录受抑。2004年Kawasaki H在MCF27细胞和哺乳动物正常上皮细 胞中用 siRNA
10、干扰 E2cadherin 启动子 CpG 岛,诱导出转甲基酶依赖的 DNA 和组蛋白 H3 赖氨酸 9 的甲基化,同时抑制了 E2cadherin 基因表达,并证实这种基因沉默发生在 转录水平。此结果显示在哺乳动物中 siRNA 诱导启动子内甲基化是一个普遍现象, siRNA 导致的转录沉默高度保守,为特异性抑制哺乳动物基因功能提供了新手段。2.3 microRNA 介导的转录水平基因沉默MicroRNA是一种单链RNA结构,长约1921nt,存在于基因组DNA的非编码区。 现有研究证据表明 miRNAs 的原始转录产物是长约 60nt 的发夹状转录前体 RNA (pri-miRNA),它含
11、有一段特殊的茎环样结构,可与靶mRNA通过尚不明确的碱基配 对方式互补结合,抑制mRNA的翻译,在基因调控方面起到重要作用。MiRNA介导翻 译水平抑制的机制:Drosha (RNasell傢族的一个亚型)能识别pri-miRNA中的茎环样 结构并与之结合,随之将茎环样结构的 RNA 片断切割释放形成 microRNA 前体 (pre-microRNA)。Pre-microRNA从细胞核内释放到胞浆,被Dicer的PAZ结构域识别 并结合,加工成类似siRNA的microRNA。成熟的microRNA由于其茎环样结构的一侧 有一段特殊序列,不能与靶mRNA完全互补,因而不能降解靶mRNA,但m
12、icroRNA能 与蛋白等结合形成RISC,结合在靶mRNA的3端非翻译区上,阻断mRNA的翻译, 进而导致相应基因的沉默。3 RNAi 技术的作用机制 6通过生化和遗传学方法的研究,现在已经提出了一个RNAi机制的模型,如图2所 示。从这个模型可以看到,RNAi技术的作用机制主要包括3个阶段。(1) 准备阶段:主要是dsRN导入细胞,可以通过直接导入、转基因或病毒导入。(2) 起始阶段:在这个阶段中,导入的dsRNA被切割成21 23个核苷酸长度的短 小的干涉RNAs ( siRNA),siRNA 被称为向导RNAs( guide RNAs)。研究表明,当Dicer 酶(剪切特异dsRNA的
13、核糖核酸酶中的RNA酶II傢族中的一员)存在时,dsRNA可被 其剪切成siRNAs,此过程需要ATP的参与。连续的剪切过程使siRNA形成19- 21bp的 双链区,并在其 3尾带2个核苷酸。(3)效应阶段:此阶段中,双链siRNA与一个核糖核酸酶复合体结合,形成RNA诱 导的沉默复合体(RISC)。它至少包括siRNA结合、Rnase和RNA解旋酶3个活性区。 首先siRNAs结合到复合体的双链RNA结合区并引导siRNA识别靶mRNA,接着 siRNA的解旋酶完成ATP依赖性的靶mRNA与siRNAs正义链换位,Rnase在靶mRNA 结合位点附近切割mRNA并将其降解。图2RNAi 技
14、术的作用机制模型4 siRNA 研究的基本实验流程首先确定要干扰的靶基因,针对靶基因应用siRNA设计软件或人工选择靶位并设计 siRNA序列;然后体外合siRNA或通过体内表达载体获得小发卡RNA( shRNA );最后 将制备的 siRNA 作用于生物体或细胞,观察及鉴定 siRNA 引起的生物体或细胞的生理 功能的变化。5 siRNA 获取的常用方法7(1)化学合成siRNA法。(2)体外转录siRNA法。(3)长片断dsRNA经Rnaselll 类酶的降解法。(4) si RNA表达载体或病毒载体在细胞内的表达。(5)使用PCR法制 备的 siRNA 表达框在细胞中的表达法。6 siR
15、NA 的设计方法 7( 1 )基因库中寻找靶向基因 mRNA 序列,并从起始密码后 75 个碱基开始寻找 AA + N19 + UU序列或AA + N19序歹U( N19为任意19个mRNA核苷酸序列);(2)计 算所选择的mRNA碱基序列中G+C比例应为30%70%; (3)选择的mRNA序列用Blast 搜寻EST基因库,确认所靶向的基因是唯一的;(4)设计21个反义RNA序列,并用 Since RNAi方法合成2条RNA链,在其二链的3末端最后2个核苷酸设计合成dTdT 序列,以减少细胞内降解。7 RNAi 技术的应用现状2-4,7-9近年来,作为一种高效、特异性强的基因阻断技术, RN
16、Ai 技术发展迅速,在生物 学基础、医学、药学和植物学等很多领域的研究均得到较大发展。7.1 RNAi 在基础学方面的研究7.1.1 高通量研究基因功能随着基因测序技术和生物信息学的不断发展,果蝇、线虫、水稻、小鼠和人类基因 组测序已经完成,而基因功能的研究步伐却相对缓慢。与传统的基因功能研究方法 (如 基因敲除、反义 RNA 技术等) 相比, RNAi 技术是一种高效、特异、快捷和成本相对 低廉的基因功能研究手段。利用RNAi技术,可以在RNA水平部分阻断某基因的表达, 获得功能性丧失,进一步研究相关基因的功能。已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中 灭活或降低特异性基因的表达,而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶 段,产生类似基因敲除的效应。双链RNAi干扰技术不仅可抑制体外细胞中特定基因的 表达,而且也可抑制体内特定基因的表