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1、RNAi 技术及其应用集美大学生物工程学院 2011 级研究生 微生物专业陈丽娜学号：2011227006摘要 RNAi (RNA interference)是指外源性双链RNA(dsRNA)能抑制细胞内与其 序列同源的基因的表达1，是近年来研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术， 它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特 异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合，使之降解，从而 阻止 mRNA 的翻译2。在进化上，这可能是生物调控基因表达及抵御病毒侵染或转座子 诱 DNA 突变的
2、一种共有的生理机制1。本文对 RNAi 技术的作用机制和应用进行了简 单的介绍。关键字 RNAi 技术 siRNA/shRNA 作用机制 应用引言RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近几年发展起来的新技术，是外源和内源性双 链 RNA 在生物体内诱导同源靶基因的 mRNA 特异性降解，导致转录后基因沉默的现象， 被Science杂志评为2001年十大科技突破之一，名列2002年十大科学之首。双链 RNA 能导致转录后基因沉默最初来自于对线虫的研究。1995 年， Guo 和 Kemphues 试 图利用反义和正义 RNA 影响秀丽新小杆线虫中 par-1 基因的表达，结
3、果意外的发现二者 同样地抑制了 par-1 基因的表达4。到 1998 年， Fire 和 Mello 在秀丽新小杆线虫中注入 dsRNA(正反链的混合物)，结果发现注入dsRNA比单独注入正链或反链RNA引起基因 沉默的效率要高得多。目前， RNAi 在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等面已显示出 广阔前景。与此同时， RNA 干扰分子机制的研究也取得了飞速发展，包括对转录水平、 转录后水平、翻译水平、基因甲基化等层次的研究。清晰阐述 RNA 干扰的作用机制将 为大规模基因系统筛查、新基因的发现、人类肿瘤及难治性疾病的基因治疗提供重要理 论依据和有力工具。1 RNAi 的功能
4、21.1抗病毒功能：RNAi现象是近年来发现的一种新的调控基因表达的重要方式，但是 研究发现，RNAi是一种非常保守的方式。所有的生物在长期的进化过程中都面临着病 毒等外来生物的入侵，生物体如何使自己的基因组免受外来核酸的入侵呢？研究表明， RNAi 机制在真核细胞中起着相当于人类免疫系统的作用，充当基因的保护者。生物体 能够将外来的细菌、病毒等的核酸的RNA降解成dsRNA，将外源RNA特异地降解。1.2 基因调控：在 RNAi 发现以前，人们认为基因研究中最重要的对象是 DNA 和蛋白 质，而RNA只起到传送DNA信息的作用，甚至错误认为很多短的RNA是一些无用的 物质。但到2000 年，
5、科学家在线虫幼虫体内发现了一类由20 多个核苷酸组成的单链微 小RNA,并将其命名为miRNA。此后，科学家又发现了 miRNA调控基因的功能，但 小RNA起如此大的作用还是首次发现。在2005年1月14日发表于美国Cel 1杂志的 论文中，怀特黑德生物医学研究所的本杰明刘易斯等研究人员说，小RNA能通过阻 断蛋白质合成的方式调控基因表达。1.3染色质浓缩：内源的siRNA，一些小RNA可能通过使染色质浓缩而调节基因表达。 一些研究小组发现dsRNA结合到植物启动子区域，能通过一种使DNA甲基化的作用导 致基因沉默；在蠕虫体内检测到许多Polycom蛋白（能结合染色质），是RNAi过程所必 须
6、的；裂殖酵母中内源siRNA可介导中心粒区染色质浓缩，导致这个位点的基因转录沉 默。1.4转座子沉默：目前，两方面的证据提示转座子沉默涉及siRNA。其一，发现蠕虫 mut-7基因参与RNAi和转位抑制。其二，从裂殖酵母的中心粒区也分离出siRNA，并 检测到这些siRNA介导此区内组蛋白甲基化。由于中心粒区包含重复序列-含转座子 片段，在一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的逆转录转座子LTR（长末端重复序 列）介导的RNAi，推测在siRNA介导的中心粒区域的组蛋白甲基化可能源于古老的转座 子沉默作用。2 RNAi 作用的分子机制 5RNAi技术在众多领域都显示出巨大应用前景，RNAi机制
7、的研究也不断取得进展, 最早关于 RNAi 机制的研究集中于转录后水平，随着研究的深入，学者发现 RNAi 的作用是在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个不同水平上实现的。2.1 siRNA/shRNA 介导的转录后基因沉默转录后抑制(post transcriptional gene silencing PTGS)是指内源基因在“异常RNA”的 诱导下发生基因沉默的调控过程。被抑制的基因能够正常转录，但转录后的 mRNA 产 物会被迅速降解而失去正常功能。所以属于转录后基因沉默。这些“异常RNA”介导RNAi 的基本模式如图 1 所示。首先，dsRNA与Dicer酶在胞浆中结合并被后者切割成
8、2123nt大小的dsRNA,被称 作siRNA。SiRNA的5端是磷酸化的,3端突出2nt。其次，siRNA与核酸酶等结合形成 RNA介导的沉默复合物(RNAinduced gene silencing,RISC)。一般认为siRNA和具有 核酸内切酶活性的 Argonaute 蛋白是 RISC 的必要组成部分。最新研究又发现两个新的 RISC 组分：VIG (vasa intronic gene )蛋白和 dFXR (Fragile X related )蛋白。RISC 中 的解旋酶在ATP作用下解旋siRNA。正义链被释放，只含反义链的RISC被激活。活化 的 RISC 通过碱基互补配对
9、原则与同源的 mRNA 结合。随后蛋白的结构域发挥核酸内切 酶的功能降解mRNA，从而使目的基因沉默。图 1 siRNA/shRNA 介导的 RNAi 的分子机制2.2 siRNA/shRNA 介导的转录水平基因沉默该机制通过 siRNA 与互补的 DNA 直接发生作用，激发同源 DNA 甲基化的加强 使目的基因转录受限，表达关闭，进而基因沉默。这一现象最初是在植物中观察到的， 与启动子区内 CpG 岛同源的 siRNA 能诱导 RNA 引导的 DNA 及组蛋白 H3 赖氨酸 9 甲基化，使靶基因转录受抑。2004年Kawasaki H在MCF27细胞和哺乳动物正常上皮细 胞中用 siRNA
10、干扰 E2cadherin 启动子 CpG 岛，诱导出转甲基酶依赖的 DNA 和组蛋白 H3 赖氨酸 9 的甲基化，同时抑制了 E2cadherin 基因表达，并证实这种基因沉默发生在 转录水平。此结果显示在哺乳动物中 siRNA 诱导启动子内甲基化是一个普遍现象， siRNA 导致的转录沉默高度保守，为特异性抑制哺乳动物基因功能提供了新手段。2.3 microRNA 介导的转录水平基因沉默MicroRNA是一种单链RNA结构，长约1921nt,存在于基因组DNA的非编码区。 现有研究证据表明 miRNAs 的原始转录产物是长约 60nt 的发夹状转录前体 RNA (pri-miRNA),它含
11、有一段特殊的茎环样结构，可与靶mRNA通过尚不明确的碱基配 对方式互补结合，抑制mRNA的翻译，在基因调控方面起到重要作用。MiRNA介导翻 译水平抑制的机制：Drosha (RNasell傢族的一个亚型)能识别pri-miRNA中的茎环样 结构并与之结合，随之将茎环样结构的 RNA 片断切割释放形成 microRNA 前体 (pre-microRNA)。Pre-microRNA从细胞核内释放到胞浆，被Dicer的PAZ结构域识别 并结合，加工成类似siRNA的microRNA。成熟的microRNA由于其茎环样结构的一侧 有一段特殊序列，不能与靶mRNA完全互补，因而不能降解靶mRNA,但m
12、icroRNA能 与蛋白等结合形成RISC，结合在靶mRNA的3端非翻译区上，阻断mRNA的翻译， 进而导致相应基因的沉默。3 RNAi 技术的作用机制 6通过生化和遗传学方法的研究，现在已经提出了一个RNAi机制的模型，如图2所 示。从这个模型可以看到，RNAi技术的作用机制主要包括3个阶段。(1) 准备阶段：主要是dsRN导入细胞，可以通过直接导入、转基因或病毒导入。(2) 起始阶段：在这个阶段中，导入的dsRNA被切割成21 23个核苷酸长度的短 小的干涉RNAs ( siRNA)，siRNA 被称为向导RNAs( guide RNAs)。研究表明，当Dicer 酶(剪切特异dsRNA的
13、核糖核酸酶中的RNA酶II傢族中的一员)存在时，dsRNA可被 其剪切成siRNAs，此过程需要ATP的参与。连续的剪切过程使siRNA形成19- 21bp的 双链区，并在其 3尾带2个核苷酸。(3)效应阶段：此阶段中，双链siRNA与一个核糖核酸酶复合体结合，形成RNA诱 导的沉默复合体(RISC)。它至少包括siRNA结合、Rnase和RNA解旋酶3个活性区。 首先siRNAs结合到复合体的双链RNA结合区并引导siRNA识别靶mRNA，接着 siRNA的解旋酶完成ATP依赖性的靶mRNA与siRNAs正义链换位,Rnase在靶mRNA 结合位点附近切割mRNA并将其降解。图2RNAi 技
14、术的作用机制模型4 siRNA 研究的基本实验流程首先确定要干扰的靶基因，针对靶基因应用siRNA设计软件或人工选择靶位并设计 siRNA序列；然后体外合siRNA或通过体内表达载体获得小发卡RNA( shRNA )；最后 将制备的 siRNA 作用于生物体或细胞，观察及鉴定 siRNA 引起的生物体或细胞的生理 功能的变化。5 siRNA 获取的常用方法7（1）化学合成siRNA法。（2）体外转录siRNA法。（3）长片断dsRNA经Rnaselll 类酶的降解法。（4） si RNA表达载体或病毒载体在细胞内的表达。（5）使用PCR法制 备的 siRNA 表达框在细胞中的表达法。6 siR
15、NA 的设计方法 7（ 1 ）基因库中寻找靶向基因 mRNA 序列，并从起始密码后 75 个碱基开始寻找 AA + N19 + UU序列或AA + N19序歹U（ N19为任意19个mRNA核苷酸序列）；（2）计 算所选择的mRNA碱基序列中G+C比例应为30%70%； （3）选择的mRNA序列用Blast 搜寻EST基因库，确认所靶向的基因是唯一的；（4）设计21个反义RNA序列，并用 Since RNAi方法合成2条RNA链，在其二链的3末端最后2个核苷酸设计合成dTdT 序列，以减少细胞内降解。7 RNAi 技术的应用现状2-4,7-9近年来，作为一种高效、特异性强的基因阻断技术， RN
16、Ai 技术发展迅速，在生物 学基础、医学、药学和植物学等很多领域的研究均得到较大发展。7.1 RNAi 在基础学方面的研究7.1.1 高通量研究基因功能随着基因测序技术和生物信息学的不断发展，果蝇、线虫、水稻、小鼠和人类基因 组测序已经完成，而基因功能的研究步伐却相对缓慢。与传统的基因功能研究方法 （如 基因敲除、反义 RNA 技术等） 相比， RNAi 技术是一种高效、特异、快捷和成本相对 低廉的基因功能研究手段。利用RNAi技术，可以在RNA水平部分阻断某基因的表达， 获得功能性丧失，进一步研究相关基因的功能。已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中 灭活或降低特异性基因的表达，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶 段，产生类似基因敲除的效应。双链RNAi干扰技术不仅可抑制体外细胞中特定基因的 表达，而且也可抑制体内特定基因的表
