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1、第六节 免疫药理学实验方法与技术简介免疫药理学是介于免疫学和药理学间的边缘学科， 主要研究药物对机体免疫系统和免疫功 能的作用及其机制，为某些疾病药物治疗提供理论基础。免疫药理学方法一般是采用体外的试管内研究和体内的整体研究相结合， 体外试验研究可 澄清药物对免疫应答某一特定环节如 T 细胞增殖、 细胞因子等产生的具体影响， 而整体研究则 可探讨药物对抗原介导的的免疫应答、 正常的体液免疫及细胞免疫功能、 同种异体移植排斥反 应、异常免疫应答如超敏反应和自身免疫病以及初次及再次免疫应答等的影响。 在未来免疫药 理学的研究领域中，基因工程、基因治疗、细胞因子治疗以及其它各种生物治疗的研究和应用
2、将是研究的热点和前沿区域。一、免疫细胞的分离与纯化 体内外的免疫药理学实验研究都需要从动物或人的血液或淋巴组织中分离免疫细胞， 获得 高纯度的免疫细胞是进行本研究的最基本的前提条件。外周血中白细胞的分离常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法；外周血单个核细胞(peripheral mononuclear cells ， PMNC )分离多采用密度梯度离心法。 从淋巴组织中分离淋巴细胞悬液- 制备脾细胞悬液、淋巴结细胞悬液、胸腺细胞悬液。淋巴细胞的分离纯化包括：分离 PMNC中的淋巴细胞和巨噬细胞常用方法有玻璃粘附法、磁铁吸引法、羰基铁乳胶分层液法、补体溶解法及葡聚糖凝胶过滤法等。T细胞、B细胞及T
3、细胞亚群的分离纯化常用技术：E花结分离法、Percoll非连续性密度梯度离心分离法、洗淘法(panning)、补体细胞毒法、尼龙毛分离法、磁性激活细胞分离器(magnetic activatedcell sorter， MACS )分离技术及流式细胞术(flow cytometry， FCM)。二、药物对免疫系统功能影响的实验技术简介1、对免疫细胞表面抗原分子的影响对细胞表面的 CD (cluster of differentiation ，分化簇)抗原的检测与分析可通过细胞毒法、 葡萄菌体蛋白 A 法、免疫细胞化学法和免疫荧光染色分析 法等， 借助流式细胞仪进行的免疫荧光染色分析法使该项技术
4、的标准化、定量化和自动化水平 大大提高，体内外药理试验均可采用之。32、对免疫细胞功能的影响 常用： 3H-TdR 掺入试验、固相抗 CD3 单克隆抗体诱导细胞 增殖的检测、混合淋巴细胞反应、抗原刺激的T细胞增殖反应、预激淋巴细胞对抗原的增殖反 应等。3、淋巴细胞功能的体内实验小鼠接触性超敏反应、 移植物抗宿主反应 ( graft-versus-hostdisease， GVHD )、迟发性超敏反应( delayed-type hypersensitivity ， DTH )、体内检测 TH 细胞活 性。4、对 B 细胞影响的体内外实验 血清中 IgG、 IgA、 IgM 的测定(单向免疫扩散
5、法、散射 比浊法)；抗体生成细胞检测(溶血空斑试验、溶血分光光度法) 。5、 对单核巨噬细胞功能的影响实验巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、 白色念珠菌 3H 葡萄糖 掺入实验、单核巨噬细胞对肿瘤细胞的细胞毒反应测定、单核因子测定等。6、 对超敏反应影响的体内外实验总 IgE 水平测定：酶联免疫吸附试验( enzyme linked immunosorbent assay， ELISA )、放射免疫单扩散法( radioactive single radial diffusion ， RSRD)、 免疫斑点法( dot immunobinding assay， DIBA )、 反向被动血凝法 ( re
6、versed passive hemagllutination assay， RPHA) 、纸片放射免疫吸附试验( paper radio immunosorbent test， PRIST) 。特异性 IgE 抗体测定： ELISA 、放射过敏原吸附试验 (radioallergosorbent test， RAST)、 P-K 试验、被动皮肤过敏反应 ( passive cutaneous anaphylaxis， PCA ) 、皮内试验 ( intradermal test)。 人外周血单个核细胞体外合成 IgE 的测定：微量固相放射免疫测定法( microtiter solid-pha
7、se radioimmunoassay， MSPRIA ）和 ELISA 法。参与 I 型超敏反应介质的测定：相应介质试剂盒 测定，如 LTs 试剂盒。动物模型：如过敏性哮喘模型等。三、影响免疫功能的药物药效学研究原则 根据药物对免疫功能的影响进行分类，可分为免疫增强剂、免疫调节剂和免疫抑制剂。1、免疫增强剂和免疫调节剂的免疫药理学研究免疫增强剂和免疫调节剂可分为两大类： 生物类和化学合成化合物类。 生物制品类包括菌 苗、细菌的某些成分如脂多糖、真菌产物、免疫细胞的产物如细胞因子和免疫球蛋白、免疫细 菌如 LAK 细胞、自然化合物及中草药及其单体成分等。化学合成化合物类包括含硫化合物、 多聚核
8、苷酸等。这些药物的药理作用因用药方案不同，如给药途径、用药剂量和用药时间等， 会导致不同的药效；另外，药物本身的纯度和药物受试对象的种系、年龄、疾病类型与程度及 遗传背景亦会对药效产生一定的影响，因此，在进行实验设计时要全面考虑这些因素。临床上免疫增强剂和免疫调节剂主要用于原发性和继发性免疫缺陷病、自身免疫病、 肿瘤及慢性微生物感染的治疗， 故选择实验动物模型时， 应考虑采用免疫缺陷模型动物、 荷 瘤动物、自身免疫病模型及相应病原体感染动物模型。2、免疫抑制剂的免疫药理学研究 免疫抑制剂的筛选程序一般是先进行体外实验， 然后进行体内实验。 动物的体内实验多采用 实验性过敏性脑脊髓炎和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的病理模型和新西兰 NZB 小鼠。在动物 实验时，应考虑动物的品系、对免疫应答所影响的环节、治疗指数、给药途径、最佳治疗方 案等。 在免疫药理学研究之后， 还应进行基础药理学研究、药物的急性和慢性毒性研究、药 物的动力学研究等。
