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1、第1章 发酵工程第2节 微生物的培养技术及应用第2课时 微生物的选择培养和计数自然界中微生物数量繁多，想要分离出特定的微生物，仅仅是通过平板划线自然界中微生物数量繁多，想要分离出特定的微生物，仅仅是通过平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。法或稀释涂布平板法很难实现。19731973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的出耐高温的DNADNA聚合酶。聚合酶。为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？这是因为水生栖热菌能在这是因为水生栖热菌能在70-8070-80的高温
2、条件下生存，而绝大多数的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。微生物在此条件下不能生存。同理：人为提供有利于目的菌生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的条件，人为提供有利于目的菌生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的条件，进行实验室微生物的筛选。进行实验室微生物的筛选。选择培养基根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。耐寒微生物耐寒微生物石油分解菌石油分解菌被石油污染被石油污染的土壤的土壤冰川冻土层冰川冻土层一、选择培养基1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供的条件（包括、和等），同时。有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的
3、生长营养温度pH2.概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。3.类型：在培养基中加入某种化学物质改变培养基中的营养成分改变微生物的培养条件3.类型:（1）改变培养条件。7080的高温分离耐高温的水生栖热菌使用将pH调至酸性的培养基分离耐酸菌（2）改变培养基中的营养成分。不加碳源（含碳有机物）的培养基不加氮源的培养基分离出固氮微生物分离出自养型微生物（3）添加某种化学物质。加入青霉素分离酵母菌、霉菌等真菌（青霉素能杀死细菌、放线菌）加入高浓度食盐的培养基分离得到金黄色葡萄球菌石油是唯一碳源分离出分解石油微生物嗜油菌金黄色葡萄球菌尿素
4、尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成壤后，被某些细菌分解成NHNH3 3，NHNH3 3再转化成再转化成NONO3 3-、NHNH4 4+等才能被植物吸收。等才能被植物吸收。土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶：CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2 脲酶思考思考讨论讨论 选择培养基配方的设计选择培养基配方的设计 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。细菌才能生长发育繁殖。1.1.将
5、土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？2.2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。养基基本相同。进一步思考 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？应该设置应该设置基础培养基基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基完全培养基作为作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌
6、落数菌多于多于该该选择培养选择培养基基，则该选择培养基，则该选择培养基具有选择性具有选择性。基础培养基基础培养基选择培养基选择培养基牛肉膏牛肉膏5.0g5.0g蛋白胨蛋白胨10.0g10.0gNaClNaCl5.0g5.0g琼脂琼脂20.0g20.0g蒸馏水蒸馏水定容到定容到1000ml1000ml培培养养基基一一KHKH2 2POPO4 41.4g1.4gNaHNaH2 2POPO4 42.1g2.1gMgSOMgSO4 47H7H2 2O O0.2g0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g10.0g尿素尿素1.0g1.0g琼脂琼脂15.0g15.0g蒸馏水蒸馏水定容到定容到1000ml1000ml培
7、培养养基基二二1.1.从物理性质来讲，两者属于从物理性质来讲，两者属于_培养基，判断培养基，判断依据是依据是_；该类培养基的主要用途；该类培养基的主要用途为为_。2.2.从用途上来讲，从用途上来讲，属于选择培养基，目属于选择培养基，目的是为了获得的是为了获得 。3.3.两种培养基共有的培养基成分有：两种培养基共有的培养基成分有：。培养基一的碳源为培养基一的碳源为 ，氮源为，氮源为 ；培养基二的碳源为培养基二的碳源为 ，氮源为，氮源为 。固体固体添加了凝固剂琼脂添加了凝固剂琼脂分离、鉴定、计数、保存分离、鉴定、计数、保存培养基二培养基二能分解尿素的微生物能分解尿素的微生物碳源、氮源、无机盐、水碳
8、源、氮源、无机盐、水牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨葡萄糖葡萄糖尿素尿素【现学现用】二、微生物的选择培养方法方法:稀释涂布平板法稀释涂布平板法主要过程主要过程:梯度稀释菌液和涂布平板梯度稀释菌液和涂布平板将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到制将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到制备好的选择培养基上，进行培养。备好的选择培养基上，进行培养。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。1g1g土壤中有土壤中有多少多少能能分解尿素分解尿素的细菌的细菌？分离：分离：获得获得分解尿素分解尿素的细菌的的细菌的纯培养物纯培养物计数：计数：测定测定分解尿分解尿素的细菌的
9、素的细菌的数量数量 土壤细菌的数量庞大，怎么获得想要得到的特定微生物的纯培养物呢？细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表38cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。操作步骤:（1）土壤取样取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。注意1101 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1 mL1103110411051106110711029mL无菌水将10 g土样加到盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。（2）样品的稀释（梯度稀释菌液）90 mL的无菌水1
10、0g土样取取0.1mL 0.1mL 菌液滴加到培养基菌液滴加到培养基表面表面1101107 7移液枪移液枪将涂布器浸将涂布器浸在盛有酒精的在盛有酒精的烧杯中烧杯中将涂布器放在火焰上灼将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布冷却后，再进行涂布用涂布器将菌液均匀地涂用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀转动培养皿，使涂布均匀（3）涂布平板微量微量移液器移液器（4）微生物培养待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置（同时放一个未接种的培养基），放入3037的恒温培养箱中培养12d。恒温培养箱在涂有合适浓度菌
11、液的平板上就可以观察到分离的单菌落。稀释稀释10103 3倍倍稀释稀释10104 4倍倍稀释稀释10105 5倍倍空白对照空白对照（1）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。结果评价:（2）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、性状、大小基本一致，并符合目的菌的菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。注意事项：注意事项三注意事项三注意事项四注意事项四注意事项一注意事项一注意事项二注意事项二将涂布器从酒精中取出
12、时，要让多余将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。过程中所有操作都应在酒精灯火过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行焰旁进行10g10g土样加入盛有土样加入盛有90mL90mL无菌水中后，无菌水中后，已稀释已稀释1010倍，在计算时，不要忽倍，在计算时，不要忽略；略；由于使用的是选择培养基，所以一般情由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可
13、以利用目的菌的代谢产物有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证来生长繁殖，所以还需要进一步验证比较平板划线法稀释涂布平板法工具接种环涂布器原理通过接种环在琼脂固体培养基的表面_操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。（不能计数）将菌液进行一系列的，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。（可计数）特点方法简单，但不适宜计数单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂平板示图共同点都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得，达到分离微生物的目的，也可以观察菌落特征。连续划线梯度稀释归纳总结：平板划线法与稀释涂布平板法的比较单菌落 当样品的稀释度足够高时，培养基表
14、面生长的一个菌落，来源于样品稀当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。有多少活菌。1.稀释涂布平板法2.显微镜直接计数法间接计数法直接计数法1.1.间接计数法间接计数法 稀释涂布平板法稀释涂布平板法选择选择30-30030-300个菌落的平板进行计数；个菌落的平板进行计数；每个每个稀释度稀释度至少取至少取3 3个个平板取其平板取其平均值平均值；统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目低实际数目低；统计的结果一般用统计的结果
15、一般用菌落数菌落数而不是活菌数来表示；而不是活菌数来表示；恰当的稀释度、涂布是否均匀恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。是成功统计菌落数目的关键。计数原则:当两个或多个细当两个或多个细胞连在一起时，平板胞连在一起时，平板上观察到的只是一个上观察到的只是一个菌落。菌落。稀释稀释10103 3倍倍稀释稀释10104 4倍倍稀释稀释10105 5倍倍空白对照空白对照三、微生物的数量测定计算公式：每g样品中的菌落数=（C V）MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）M：稀释倍数【例】某同学在均使用0.1mL菌液，稀释倍数为105的培养基中测得3个
16、平板上菌落数为80、90、100，那么每g样品中菌落数是（）A.900 B.9.0107 C.90 D.9.0106 B三、微生物的数量测定（80+90+100）/30.1 105=9 107个个2.2.直接计数法直接计数法 显微镜直接计数法显微镜直接计数法 利用利用细菌计数板细菌计数板或或血细胞计数板血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。中微生物的数量。缺点：缺点：a.不能区分死菌和活菌不能区分死菌和活菌偏大。偏大。b.不适于对运动细菌的计数。不适于对运动细菌的计数。c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。个体小的细菌在显微镜下难以观察。优点：优点：快速、直观快速、直观血细胞计数板：血细胞计数板：细菌计数板：细菌计数板：常用于常用于相对较大相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。对细菌等对细菌等较小的细胞较小的细胞进行观察和计数。进行观察和计数。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。中方格小方格血细胞计数板（双线分割）大方格边长为1mm，深度为0.1mm1个计数室的体积为0.1
