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1、NogoA、B蛋白在RCS大鼠视网膜色素变性过程中表达的研究耿慧萍，贺翔鸽(400042重庆，第三军医大学第三附属医院野战外科研究所，眼科医院)【摘要】目的观察髓磷脂抑制蛋白NogoA、B在遗传性视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)经典遗传模型皇家学院外科大鼠(Royalcollegeofsurgeonsrat,RCS)出生后视网膜变性发展过程中的表达并探讨其意义。方法按出生后视网膜变性的发展程度将RCS-p+(视网膜含色素的变性大鼠)分为P15d、P30d、P60d和P90d4组，采用相应时期的RCS-rdy+p+(视网膜含色素的正常大鼠)作为对照，利用亲和免疫组织
2、化学技术(Immunohistochemistry,IH)及免疫印记(westernblotting，WB)技术检测两组RCS视网膜上NogoA、B蛋白的表达趋势。结果与对照组相比，1、P15d和P30d，RCS-p+大鼠视网膜各层结构和细胞数目无明显变化，仅节细胞数目轻微减少；P60d、P90d大鼠视网膜外核层(Outernuclearlayer，ONL)和内核层(Innernuclearlayer，INL)结构出现明显紊乱，细胞数目的减少以ONL和神经节细胞层(Ganglioncelllayer，RGC)层为主。2、IH显示NogoA、B蛋白在RCS-p+大鼠各时间段视网膜表达均为阳性，P
3、15d开始出现，随病程发展呈升高趋势，主要表达在INL和RGC层，阳性细胞数目显著高于对照组。3、WB免疫印记检测结果显示P15d、P30d、P60d和P90dNogoA蛋白表达量分别为：0.827370.21292、1.110190.08999、1.31552).02857、1.26881).08042,与对照组相比有显著差异(P0.05)。同时检测到NogoB1蛋白和NogoB2蛋白的表达，其中NogoB2蛋白与NogoA蛋白表达趋势一致，但总体表达量较低。结论RCS大鼠视网膜色素变性发展过程中，RGC层与视网膜外层结构同时出现改变。色素变性视网膜上NogoA、B蛋白的表达，证明RP过程中
4、视网膜视神经损伤的存在，NogoA蛋白可能参与了视网膜色素变性过程中视神经再生修复的抑制作用，NogoB蛋白的作用尚不确定。关键字视网膜色素变性；Nogo蛋白；皇家外科学院大鼠RCS(Royalcollegeofsurgeonsrat,RCS)中文图书分类号R774.1TheexpressionofNogoAproteininthedegenerationofretinitispigmentosaGengHui-ping，HeXiang-ge*DepartmentofOphthalmology,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,TheThird
5、MilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,ChinaAbstractObjectiveToInvestigatetheexpressiontendencyandsignificanceofNogoA、BproteininretinaofRCS(Royalcollegeofsurgeonsrat,RCSrat),aclassicgeneticanimalmodelwithhereditaryretinaldegenerationafterbirth.MethodsAccordingtoretinaldegenerationdevelopmentstatu
6、s,RCS-p+(RCSratswithinheritedretinaldystrophy)weredividedinto4groups:P15d、P30d、P60d、P90d,respectivelythecorrespondingperiodoftheRCS-rdy+p+(RCSratwithoutretinaldegeneration)servedasthecontrolgroups(C15d、C30d、C60d、C90d),immunohistochemicaltechniquesandimmuneimprinting(WesternblottingWB)methodwereusedt
7、odetecttheexpressionpatternandthequantitychangeofNogoA、BproteininretinaltissueofRCSrats(RCS-p+/RCS-rdy+p+)at4timepointspostnatal.ResultsComparedtothecontrolgroups,1,noobviouschangeappearsatthecellnumberandthethicknessoftheretinaintheP15dandP30d,exceptfortheslightdecreaseofRGCnumber;butIntheP60dandP9
8、0d,wecanobservedapparentstructuredisorderinONLandINLofretinal.Inaddition,themostpronouncedlessnumberofcellsappearedinONLandRGClayer.2,ImmunohistochemistryshowedobviouspositiveexpressionofNogoA、Bproteinappearedineachperiod,beginningatP15dandincreasedwiththeretinaldegenerationprocess,mainlylocatedinIN
9、LandRGClayer.Thepositiveexpressionisobviouslyhigherthanthecontrol.3,WBimmunoblottingshowthatatP15d、P30d、P60d、P90d,thegrayvalueofNogoAproteinwererespectively0.82737+0.21292,1.11019+0.08999,1.31552+0.02857,1.26881+0.08042,whichissignificantdifferentwiththecontrolgroups(P0.05).Atthesametime,wedetectedt
10、hatthepositiveexpressionofNogoB1andNogoB2,NogoB2proteinhavetheconsistentexpressiontendencywithNogoAprotein,butthequantityislowerrelatively.Conclusion:DuringtheretinaldegenerationprocessofRCSratwithretinitispigmentosa,simultaneouslymorphologicalchangesappearedinRGClayerandtheretinaouterlayer.Theexpre
11、ssionofNogoA、BintheINLandRGClayerisoneoftheevidenceforopticnervedamageduringthedegenerationofretinitispigmentosa.Therefore,NogoAproteinpossibilityinvolvedintheinhibitingtheregenerateandrepairofopticnerveduringthedegenerationofretinitspigmentosa，theaffectofNogoBcannotsure.keywordsRetinitispigmentosa；
12、Nogoprotein；Royalcollegeofsurgeonsrat,RCS作者：耿慧萍女硕士初级青光眼视神经保护的诊断和研究Correspondingauthor:HEXianggeE-mail:原发性视网膜色素变性亦称为色素性视网膜炎（retinitispigmentosa，RP）,是一类以进行性感光细胞和色素上皮层功能障碍为特征的遗传性视网膜退行性疾病，但其最终致盲的主要原因是视神经的损伤。Nogo蛋白是一种髓磷脂抑制蛋白，对中枢神经系统（Centralnervoussystem，CNS）神经损伤后神经元轴突生长具有明显抑制作用。最近研究表明Nogo蛋白在多种眼科疾病及视神经损伤中
13、也发挥一定抑制作用，但在RP这种退行性视网膜变性疾病过程中是否也存在直接导致视神经细胞凋亡的抑制因素如Nogo蛋白，尚未见报道。本研究主要对RCS大鼠视网膜变性过程中NogoA、B蛋白的表达进行观察，为进一步探索RP的发病机制和治疗方法奠定基础。1.1.1 1材料和方法材料实验动物分别取出生后15天（标记为P15d,post-natal15day）、30天（P30d）、60天（P60d）、90天（P90d）四个时间点的RCS大鼠（RCS-p+,视网膜含色素的变性大鼠）做为实验组，以相同时间点的（RCS-rdy+p+，视网膜含色素的正常大鼠）作为对照组（由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动
14、物中心提供），每个时间点各取大鼠5只，雌雄不限。1.2.1.1 主要试剂与仪器兔抗大鼠NogoA+B多克隆抗体（英国Abcam公司，ab47085），辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG抗体（北京中杉金桥生物技术公司），TritonX-100（美国，sigma公司，9002-93-1）,化学增强发光试剂盒（WesternBlotChemiluminescenceReagentPlus），冰冻切片机型号LeicaCM1900（德国Leica公司），光学显微镜（德国Leica公司），DU-600紫外分光光度计（Beckman，美国），电泳仪及电泳槽（BioBad，美国），TRANS-BLOT
15、SD半干电转移细胞（BioRad，美国），扫描分析软件系统（LabworksAanlysisSoftware，美国）方法亲和免疫组织化学技术视网膜石蜡切片准备速眠新（1ml/kg）腹腔麻醉，打开胸腔左心室插管，剪开右心房，0.9%Nacl溶液灌注冲洗至流出液基本清亮，用预冷的4%多聚甲醛灌注，取双侧眼球置于4%的多聚甲醛4C固定过夜。Zeiss手术显微镜下去除眼前节及玻璃体，常规石蜡包埋，制成5um厚的连续石蜡切片。免疫组化反应石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，采用胰酶修复抗原后3%H2O2室温孵育5-10分钟，PBS冲洗5分钟，置于0.3%TritonX-100浸泡10min,
16、室温下5-10%血清封闭30分钟，在PBS漂洗5分钟。将切片用兔抗大鼠NogoA+B多克隆抗体（1:1500，北京中杉金桥生物技术公司抗体专用稀释液稀释）先4C过夜，后室温37C下孵育60min;对照组用PBS液代替一抗。接着PBS漂洗5minX3次。滴加适当比例稀释的山羊抗兔生物素标记二抗（1:200）,37C或室温孵育60min。PBS漂洗5minX3次，滴加辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素，37C或室温孵育30min。PBS漂洗5minX3次，DAB显色，复染，脱水，透明，封片。最后在光学纤维镜下观察，拍照。Westernblot免疫印迹技术1.221视网膜组织蛋白提取及鉴定速眠新麻醉，断颈处死，直接取双侧眼球置于冰盒内，Zeiss显微镜下去除眼前节，剥离视网膜，剪取l-2g置于冻存管中，-80C保存备用。取视网膜标本2g加细胞裂解液1ml，冰浴下超声破碎15s，冰浴30min,4C,2000g,30m
