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1、2008-6 Volume 8疏水层析填料疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一般而言，离子强度 （盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH,表面活化剂和有机溶剂。 疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：CellfineTM Butyl, Phenyl和Octyl,分别为在多孔的交联纤维素颗粒 上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图：填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依
2、次增大。通常，CellfineTM Octyl对疏水性蛋白的吸附性会强于 CellfineTM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗脱。CellfineTM Phenyl,具芳香族物质 的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时， 没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）色谱柱：8.2 x 150 mm柱体积：8 ml流动相：2.0 0.0MAmmonium Sulfatein 0.01M phosphate, pH 7.0流 速：
3、1.32 ml/min样 品：5 mg/3 ml 100 pl2008-6 Volume 8ipak NH2PAsahipak NH2P色谱柱（氨基柱）谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。Asahipak NH2P色谱柱，是以聚合物为基 材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱相比，聚合物基材的氨基柱Asahipak NH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，Asahipak NH2P 可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。NH2P-50 4ESiliG日based amino co I
4、 umn聚合物基材氨基柱与硅胶基材氨基柱的柱寿命比较 First useAfter 120hrsAfter 180hrsmlnT, Fructose 3 Qiuuu0 103-4. Maltabe1. Fruclo2-3 Sucross4. MaKoftiFirst usemln左图为Asahipak NH2P色谱柱与硅胶基材氨基 柱的寿命对比试验。结果显示：随着使用时间的延长，硅胶基材氨基柱对单糖、二糖的保留快速下ie叫Asahipak*NH2P色谱柱可在正相Sucroseg FruciOM祓ISO 100Time (hr)色谱柱:10Sucre50100 IM 2MTimfl (hrV&t
5、mL)2Qh降，其原因应是硅胶基材氨基柱的氨基降解所致。Asahipak NH2P-50 4E,其它公司的氨基柱(4.6mmID*250mm)流动相:流速:检测器:CH3CN/H2O=75/251.0mL/minShodex RI柱温：30度:下分离糖类物质,，糖类物质按照分子量由LidTipled Rhamncse b Fructosec. Glucono d Sucrosef. Raffinose小到大的顺序依次被洗脱。增加洗脱液中有机溶剂的比例可以延迟糖类的洗脱时间。Asahipak NH2P色谱柱可以在碱性，室温条件下分离单糖、二糖和糖醇混合 物。右图为Asahipak NH2P色谱柱
6、分离单糖、二糖及三糖混合物的应用实例。单糖、二糖及三糖混合物的分离色谱柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4.6mmID*250mm)流动相： H2O/CH3CN=25/75流 速： 1.0mL/min 检测器： Shodex RI 柱 温： 30 度2008-6 Volume 8学习园地导致色谱柱柱压升高的原因及解决方案第一阶段：确认是柱子导致的压力上升，还是HPLC系统导致的压力上升。由于HPLC系统有很多环节，如泵、管路等，都容易吸附和积聚杂质，这些因素均会导致压力上升，所以，应先对 HPLC系统进性排查。排查方法：取下色谱柱，仅用管路连接并正常输送流动相时记录系
7、统压力。如果此时HPLC系统压力正常，则考虑 是柱压升高。第二阶段：确定是否使用了保护柱(预柱)。一般在测定容易堵塞色谱柱的样品时，应该使用保护柱。如果使用了保护柱，那么压力的升高就有可能是保护柱的 柱压升高导致的。排查方法：取下色谱柱，仅以保护柱连接管路并正常输送流动相测试柱压，再反过来取下保护柱仅以色谱柱连接管 路正常输送流动相测试柱压，如果仅当连接保护柱时柱压高的话，则为保护柱引起的柱压升高，请清洗、或更换保护 柱。第三阶段：如果不是上述第一、第二点原因造成压力升高，就可以确认是色谱柱的原因了。如果柱压是随着使用时间的延长，慢慢上升，这属于正常现象，是色谱柱达到使用寿命了，只能更换色谱柱
8、了。 如果柱压是在实验开始时，实施中或经过一次、几次实验后，突然上升，则要结合实验情况考虑以下因素：原因解决方案色谱柱柱长色谱柱越长，柱压越高。可根据实验情况适当减小柱长。柱内径柱内径越小，柱压越高。可选择大内径色谱柱。填料基质的形态填料的形态也会对柱压有影响。硅胶基质的形态可以分为无定形和 球形两种，现在一般装柱使用球形硅胶。颗粒大小小粒径填料装填的色谱柱柱压较高，在不影响分离效果的同时，可 选择大粒径的填料。填料合成条件及装柱 条件不同厂家生产的色谱柱有的柱压可能相差4、5个MPa，特别是低端 和高端色谱柱之间，这一区别比较明显。例如：YMC公司生产的色 谱柱，就属于高效高压型的。流动相流
9、动相的前处理流动相中存在的杂质也会堵塞色谱柱，引起柱压升高。因此，在实 验前应进行必要的试剂前处理，包括滤膜过滤，用固相萃取方法去 除容易吸附于色谱柱填料的强疏水性杂质。流动相的种类不同流动相，因其理化性质差异，产生的柱压有所差异。例如：乙 腈产生的压力低于甲醇，但两者的分离效果相似。在某些情况下， 可以通过替换流动相的种类减小柱压。混合流动相的比例流动相成分间的比例，也可以引起柱压的差异。如：当甲醇/水=50/50时，柱压就较咼。可以通过调整流动相成分间的比例降低柱压。温度温度的变化也会导致柱压的变化。最好使用柱温箱控温，可根据实 验情况，适当升高柱温以减小柱压。样品含有不溶性成分过滤样品，
10、充分离心，防止堵塞预柱及色谱柱，引起柱压升咼。盐分样品或缓冲液中的盐分结晶于柱内，也可引起柱压升高。如：乙酸 铵。根据实验情况，清洗色谱柱中的盐分，从而降低柱压。如：先 用4050 C的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相 应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯 甲醇冲洗柱子30分钟。被填料吸附沉积样品污染沉积也会导致柱压升咼。须根据实验情况和柱子类型进行 清洗。（常规的清洗方法如下。）常规的色谱柱清洗方法（正向冲洗）使用比目前使用的流动相对样品溶解能力更强的试剂清洗色谱柱。如果您使用的流动相是乙腈：水（ 70:30），请使 用更高浓度的乙腈水溶液进行清洗，比如乙腈
11、：水（80:20）或乙腈：水（90:10）。但是，如果高浓度的乙腈水溶液导致 样品溶解困难的话，请停止使用上述流动相，转而使用对样品易溶的流动相。如果该方法仍不见效，请试用下述方法。色谱柱清洗方法（反向冲洗） 将色谱柱反向连接（即与色谱柱上箭头标识相反的方向使流动相由出口处流入、入口处流出）输送流动相试试。此 时，如果柱压太高会对色谱柱造成损坏，所以请将流速调至平时操作时的一半。但是，如果使用相同的流速，反洗比正 向清洗柱压还低的话，可能会发生色谱柱入口处的填料在筛板处聚集，那么就使用原有流速进行反洗。反洗流动相的选 择与上述正向冲洗相同，请选用比平时使用的流动相溶解性更强的、更易溶解样品的流动相。注意，反洗时请断开检测器的管路连接，以避免污染检测器。 反洗色谱柱容易对色谱柱造成伤害，不到万不得已不要轻易使用。 本期的内容就先介绍到这里，欢迎大家各抒己见，希望以上内容能对大家的学习工作有所帮助。
