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1、毕业设计(论文)课 题 名 称 枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究 年 5 月 15 日目 录摘 要2Abstract31 前言42 材料与措施72.1 实验试剂与材料72.2 重要仪器与设备72.3 实验措施83 成果与分析8 3.1枯草芽孢杆菌的原则曲9 3.2单因素实验成果10 3.3 正交实验成果分析134 结论和讨论155参照文献166道谢17 枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究 摘 要 本文通过单因素实验和正交实验研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的发酵条件（PH、温度、时间、接种量）对枯草芽孢杆菌生长量的影响。本实验的枯草芽孢杆菌在BPG液体培养基上培养，通过单因实验
2、及正交实验得到最佳的发酵培养条件为：初始pH 7.0；温度35；时间20h；接种量为5%。在此培养条件下的活菌液量为3.785107CFU/ml，相比在LB培养基下培养时的活菌液量3.2106CFU/ml提高了10倍左右。核心字：枯草芽孢杆菌；正交实验；生长量Optimization study of bacillus subtilis culture conditions AbstractIn this paper, we study Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) fermentation conditions (PH, temperature,
3、 time, quantity of) the impact on the growth of Bacillus subtilis. The experiment of bacillus subtilis in combined cultivated in liquid medium, is obtained by single for experiment and the orthogonal experiment the best fermentation culture conditions as follows: the initial PH 7.0. Temperature 35 ;
4、 Time 20 h; Inoculation quantity was 5%. Under the condition of the cultivation of the best amount of bacterium fluid is 3.785 x 107 cfu/ml, compared to when cultured in LB medium under the microbial quantity: 3.231 x 107 cfu/ml by about 10 times.Key words: Bacillus subtilis; Culture conditions; inc
5、rement1 前言 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种好氧性产芽孢杆状细菌(G+)1，其基本特性：杆菌：一般 0.7-0.82.0-3.0 m，电子显微镜测量为 0.5-0.61.1-3.5 m，着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。 由于枯草芽孢杆菌是需氧菌在水质净化2、工业发酵中发挥着重要的作用，人们开始致力于研究枯草芽孢杆菌应用于这些方面的研究。有关枯草芽孢杆菌的研究与应用已有100近年的历史，初
6、期大部分工作集中在形态观测、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。近年来，对枯草芽孢杆菌的研究渐进到遗传学与分子生物学领域，研究内容体目前特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等。但目前对该菌种的研究仍然处在实验室的初始阶段的水平。但是枯草研报杆菌有一系列的优良性状吸引这某些的科学家的目光，她们相信随着经济的发展，枯草芽抱杆菌资源对在工、农、医等方面有重大应用价值，开发运用更具有重要意义。枯草芽孢杆菌是一类广泛分布于多种不同生活环境中的革兰氏阳性杆状好养型细菌，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强3，在土壤和植物的表面普遍存在，同步还是
7、植物体内常用的一种内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境。由于枯草芽孢杆菌生长速度快，营养需求简朴，易于存活，定殖与繁殖，无致病性，并可以分泌多种酶和抗生素4,5，并且还具有良好的发酵基本，用途十分广泛，国内外有众多研究单位和学者对此菌进行了大量研究，也积累了丰富的研究资料。通过对枯草芽孢杆菌系列的研究，一方积累枯草芽孢杆菌规律信息为后来开发提供根据；另一方面也可理解芽孢杆菌与生态环境间的互相关系，为芽孢杆菌资源的运用奠定基本6 。目前对于枯草芽孢杆菌的重要运用方面：（1）在水产养殖中的应用随着水产养殖业的迅猛发展和集约化经营限度的不断提高，养殖水体污染日趋严重，许多养殖池中有害藻类及病菌大量繁殖
8、，水质条件不断恶化，其后果影响到了水产品安全和产业的可持续发展7。运用常规药物防治措施，不仅易加重水质恶化限度，成本也较高，而运用微生物制剂改善养殖水体环境受到人们越来越多的关注。枯草芽孢杆菌是一种好氧的革兰氏阳性菌，在自然界广泛存在，生命力极强，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境，具有广谱的抗菌活性和极强的抗逆能力8。枯草芽孢杆菌能有效的降解水体中的氨氮、亚硝酸盐和硫化物，达到净化水质的目的。因此，枯草芽孢杆菌在养殖水体的生物修复方面得到了广泛的应用9,10。在水体或饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂，可以有效克制或杀灭水体中或养殖生物体内的某些有害致病菌，并且能增强有益菌的群落，而达到防治水产疾病的
9、目的；芽孢杆菌可以减少水体中硝酸盐、亚硝酸盐的含量，从而起到改善水质的作用11；芽孢杆菌还可以通过消灭病原体或减少病原体的影响来改善水质；枯草芽孢杆菌对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物有很强的克制作用，有效避免水产动物肠炎，烂鳃等疾病。同步枯草芽孢杆菌也可以分泌大量几丁质酶的功能。几丁质酶可分解病原真菌的细胞壁而克制真菌病害，分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质12-14；也可以分解池中残饵、粪便、有机物等，具有很强的清理水中垃圾小颗粒的作用。枯草芽孢杆菌还可以改善有害蓝藻泛溢导致的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能。其在水中大量繁殖时分泌的胞外酶可分解、吸取水及底
10、泥中的蛋白质、淀粉、脂肪等有机物，有减少水体富营养化和清除底泥的作用。在作用过程中，可以增进饲料中营养素降解，有机营养一部分转化为细胞物质，大部分转化为细菌活动的能量。在其转化过程中，氨气、氮气就从水中逸散到大气用这种措施，水中氨氮和硝基氮可除去 。另一部分有机营养转化为优势的有益菌体，此法广泛应用于河蟹、育苗、虾、甲鱼养殖15。 （2）在食品工业上的应用血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率和死亡率居多种疾病之首。大量的研究表白，饮食习惯与动脉硬化和血栓等疾病有密切的关系，纳豆是日本的老式食品，已有近年的历史。纳豆是由纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌发酵大豆而成。日本学者发目前枯草杆菌发现
11、的老式纳豆(Natto)食品中具有一种具有溶解血栓功能的纳豆激酶(Nattokinase)是一种枯草杆菌蛋白激酶16，可简称为枯激酶(Bacillokinase)。该酶在体内除可溶解血栓外，明显地缩短优球蛋白的溶解时间(ELT)，以及激活体内的血管内皮细胞产生t-PA，由此可见，可摸索开发一种新的溶栓药物。纳豆是日本的老式食品，已有近年的历史。由于纳豆中具有能溶解血栓的纳豆激酶17，因此很适合伙为一种保健食品每天食用。研究表白，每天食用150 g新鲜纳豆可起到避免血栓类疾病的作用。此外，常吃纳豆对癌症、糖尿病、高血压、动脉硬化、肥胖病等均可起到避免和缓和及治疗作用.纳豆枯草芽孢杆菌能在肠道内生
12、长，分泌多种酶和维生素，增进小肠黏膜细胞的增殖18-19，增进胃肠道多种消化酶活性，并具有克制肠道内有害菌的作用，可以将人类及其她动物难以消化吸取的大豆蛋白发酵形成大豆多肽和小分子物质的混合物；同步此菌在不利环境中形成芽胞，能耐高温高压，经受饲料加工工艺规定，易贮存。目前诸多研究均显示，枯草芽胞杆菌可以产生多种抗菌物质20克制病原菌的繁殖并且对生物体自身无害，可提高养殖动物的产品质量，是一种应用非常广泛的益生菌。因此，近年来枯草芽胞杆菌在饲料开发和生物防治等领域的应用成为研究热点。 （3）在医药方面的应用枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来避免和治
13、疗烧伤面的感染。科学家发现从枯草芽孢杆菌提取到的淀粉酶、纤维素酶可以补充体内消化酶的局限性，恢复正常消化机能；蛋白酶可以分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周边的坏疽腐肉和碎屑。枯草芽孢杆菌可以分泌多种酶，其中可以应用到医药领域的酶重要有丝氨酸纤溶性蛋白酶 ( 纳豆激酶) 和脂肪酶两种21。日本人平常生活中食用的纳豆就是运用枯草芽孢杆菌生产的，纳豆中具有的纳豆激酶对心血管疾病有较好的避免和治疗作用。近年来，国内也掀起对纳豆激酶的研究和开发热潮，纳豆激酶的药用价值日益突出，在国内老式大豆发酵食品豆豉中发现了类似纳豆激酶的高活力的纤溶酶，将其产生菌株鉴定为枯草芽孢杆菌，并将豆豉纤溶酶基因克隆到了
14、毕赤酵母中。同样由枯草芽孢杆菌合成的聚谷氨酸也可用作药物缓释材料和医用高分子纤维材料等 。随着人们对枯草芽孢杆菌性质的进一步，发现芽孢杆菌具有稳定性好、抗性强、耐高温、耐酸碱1、克制病原菌繁殖、 产生多种酶类、提高动物消化酶活性、分解有机污染物、净化水质等长处，而被广泛应用于水产动物养殖中；于此同步枯草芽孢杆菌又可以产生微生物源性抗菌蛋白2；从而国内外研究者掀起对拮抗菌株的筛选、鉴定以及其抗菌物质理化特点等方面进行了大量研究工作的热潮，虽然在实际的应用中，大多停留在实验室等机构实验阶段，但它所呈现的应用前景却十分广阔。枯草芽孢杆菌在培养过程中，由于培养条件掌握不好，常浮现活菌数量低、芽孢形成率
15、低等问题，因此本课题尝试通过变化BPG培养基的培养条件来提高枯草芽孢杆菌的产量，盼望解决在现阶段的工业化生产中存在着的菌数量低、成本高的问题。本课题是针对菌株合适培养基的发酵条件进行研究。针对发酵液培养基中不同温度、pH、菌种接种量、时间分别进行单因素水平的实验，拟定三个较好的水平，在进行四因素三水平正交实验以拟定枯草芽孢杆菌的最佳条件。对此我们对发酵培养基进行优化实验，以提高枯草芽孢杆菌的产量并减少生产成本。研究的目的是通过优化发酵培养基的培养条件，提高芽孢杆菌菌株发酵液的含菌量，为大规模工业化生产奠定基本，有助于减少生产成本。2 材料与措施2.1 实验试剂与材料2.2.1材料枯草芽孢杆菌（湖南师范大学微生物实验室提供）2.2.2实验试剂 牛肉膏；蛋白胨；葡萄糖；可溶性淀粉；氯化钠；磷酸氢二钾；硫酸锰；琼脂；去离子水2.2 重要仪器与设备 超净工作台；灭菌锅；培养皿若干；电子天平；250ml锥形瓶若干；玻璃棒；酒精灯；试管；移液管；移液枪；分光光度计2.3 实验措施2.3 实验过程 曲线制备 单因素测定 正交实
