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1、1. 印迹基因的概念及重要意义 概念:基因组印迹是特指来源于亲本的等位基因进行不对称后成修饰后而导致的单等位 基因表达的现象。这种在生物进化中形成的、有规律而又受控的基因失活是机体中基因 表达调节的一种重要方式。2. 研究印迹基因的重要意义: 已有的资料显示，印迹基因对胎儿生前的生长及其谱系发育起着重要的作用，动物的发 育过程、某些遗传疾病及癌症的发生过程都与基因印迹密切相关；印迹基因在哺乳动物 配子中总是优先表达，这就开启了一个与发育相关的重要开关，使哺乳动物能依据环境 的特点向最优化的种系方向发育。进一步筛选出和克隆出更多新的印迹基因，并进行印 迹机制的深入研究对于进一步理解个体发育、遗传
2、疾病及癌症的发生机制具有重要的意 义。3. 印迹机制 在哺乳动物中所发现的印记基因大都具有如下几个特点： 很少是单独存在的，大约有 80%以上都是与其他的印记基因呈簇排列； 所有的印记基因都有一个或几个印记中心 IC ( imprinting center, IC )，也即差异甲基 化区 DMR( differentially methylated region, DMR)； 在印记基因的DMR内，有富含CpG的CpG区(CpG island)； 基因印记是可以逆转的。4. 哺乳动物印迹基因的生命周期(如附图1)：哺乳动物印迹基因的生命周期大致可概括为印迹的建立印迹的维持印迹的去除通过实验分析
3、证明DMR对印迹具有首要的重要性，一个DMR也可称之为印迹调控区 (ICR),ICR是如何对体细胞中单等位基因表达进行调节的呢？(附图2.)(1) ICR作为基因调控的元件，必须通过顺式作用明显地能影响基因的表达。(2) 这些 ICR 调控元件能通过甲基化或甲基化缺失使一个亲本的等位基因处于“关”的状 态，而另一个亲本的等位基因则处于“开”的状态，这种效应能通过配子遗传。这就产生 了等位基因的反式活化或失活，即单等位基因的表达。(3) 含有多个印迹基因的大基因蔟需要通过一个双向印迹中心来调控双亲的等位基因5. 印迹基因研究模型 研究基因研究模型主要有:(1) 干细胞(2) 利用平衡易位(如相互
4、易位和罗伯逊易位)获得的杂合胚胎(3) 大片断 DNA 转基因动物干细胞作为印迹基因研究模型所具有的优良特性:(1) 干细胞是二倍体，他们仅含有父源或母源的染色体并可诱导分化，使其最终分化为孤雌 胚胎、孤雄胚胎或不对称的父母源染色体区；(2) 进行嵌合体发育潜能评估实验时，它能保留印迹；(3) 能提供一个基本的胚胎和嵌合体体外分化体系；(4) 能够提供足量的细胞物质(如DNA)以用于染色体结构分析。干细胞作为印迹基因研究模型存在的缺点: 干细胞这种诱导和分化的无限制性，可能会导致其后成遗传学的变化 ES 细胞中印迹基因的等位基因特异甲基化模式及其表达模式在发育的不同阶段是不稳 定的 ,这种不稳
5、定性常常可导致胚胎发育的异常利用平衡易位(如相互易位和罗伯逊易位)获得的杂合胚胎是印迹基因研究较好的一个模型, 这是因为:相互易位和罗伯逊易位可用于产生单亲二倍体(UPD),或在染色体的全部或局部区域产生单 亲的复制位点或缺失位点(uniparental duplication/defi ciency)。携带有 UPD 或 uniparental duplication/deficiency 的小鼠具有正常二倍染色体的成分,然而,父母源基因可能会受到干 扰,结果使小鼠的某些遗传秉承单亲的特性。遗传分析表明,如果常染色体受到干扰,往往 会出现一些不正常的发育现象,分离出这些缺陷胚胎和它们同窝的正
6、常胚胎,就可以获得很 有价值的材料以用于基因组印迹区域的分子生物学和发育生物学特性研究。不足之处:在不同的动物,或许产生平衡易位的概率不同 。例如,在小鼠中很容易通过相互易位和罗伯 逊易位产生不对称的父母源印迹区域,但在人类,这种情况出现的概率很小。利用大片断DNA转基因动物来研究基因组印迹 的原因：小片断的DNA转基因技术不宜用于基因组印迹分析，因为在人类和小鼠日益增长的实验数 据显示，印迹基因的调控元件往往弥散得很广，可以达到数百kb,利用小片断的DNA转基 因将不可能提供这些稀有基因的表达和印迹机制的大量信息。转基因技术的发展，使大片断 DNA转基因技术开始建立起来，如BAC和YAC转基
7、因技术，这种技术在印迹基因的分析 上与先前的小片断的DNA转基因技术相比，是一个更强大的工具。利用大片断DNA转基因动物来研究基因组印迹存在的困难：大片断DNA的构建和纯化与小片断DNA相比要困难得多6. 印迹基因的鉴定技术：大多数学者采用了基因组扫描技术或把这种技术与甲基化分析方法相结合。这些方法主要有 差异显示PCR ( DDPCR )、消减杂交、代表性差异分析(RDA )、 termed methylation-sensitive amplicon subtraction (MS-AS)、抑制消减杂交(SSH)和限制性界标基 因组扫描技术(RLGS)等。RLGS方法主要是基于基因组DNA
8、限制性酶切末端标记和二维凝胶电泳分离。在比较二维 电泳图谱的大量的片断的基础上寻找感兴趣的片断。这种工作比较烦琐，但现在已有学者开 发了相关的软件，使这种筛选基因的工作量大大地降低了。用这种方法已发现了若干个印迹 基因，但这种方法需要较多的起始物质用于分析，对于细胞来源有限的组织来说，如哺乳动 物的卵子和胚胎，不宜采用该方法。差异显示PCR(DD PCR)、消减杂交和代表性差异分析(RDA)也相继克隆出一些新基 因或差异表达基因，但这些方法仍存在操作繁锁,假阳性高， 上调表达难于分析等缺点。 1996 年 Diatchenko 等提出了一种可克服上述缺点的克隆基因的新方法 抑制消减杂交 (SSH)。SSH是抑制PCR与消减杂交技术相结合的更简单更快速的分离差异基因的方法。
