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1、动物组织中硝基呋喃类代谢物残留的测定 酶联免疫吸附法编制说明（征求意见稿）一、标准制定的背景及任务来源1、 背景（标准制定的重要性和必要性）硝基呋喃类药物是人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，主要是指呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃它酮（Furaltadone）、呋喃西林（Nitrofurazo- ne）、呋喃妥因（Nitrofurantoin）。代谢产物见下表：常见动物源性食品中硝基呋喃类药物原物名称代谢物呋喃唑酮（Furazolidone）3-氨基-2-恶唑酮（AOZ）呋喃它酮（Furaltadone）5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮（AMOZ）呋喃西林（Ni
2、trofurazone）氨基脲（SEM）呋喃妥因（Nitrofurantoin）1-氨基-乙内酰脲（AHD）硝基呋喃类抗生素因其具有抑菌性和杀菌性而曾广泛用于家禽、家畜、水产、蜂等动物传染病的预防和治疗以及饲料添加剂中。但该类药物对养殖动物有毒性作用，大剂量或长期连续使用，易出现毒性反应；且硝基呋喃类化合物是直接致变剂，它不用附加外源性激活系统就可以引起细菌的突变，呋喃它酮为强致癌性药物，呋喃唑酮具中等强度致癌性。同时，硝基呋喃类药物在体内代谢迅速，代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，可长期保持稳定，从而延缓药物在体内的消除速度。普通的食品加工方法（如烧烤、微波加工、烹调等）难以使
3、蛋白结合态硝基呋喃残留物降解，但这些代谢物可以在弱酸性条件下从蛋白质中释放出来。因此，当含有硝基呋喃类抗生素残留的食品为人所食用后，这些代谢物就可以在胃酸作用下从蛋白质中释放而被人体吸收，造成严重危害。鉴于硝基呋喃类药物残留的严重危害，目前，欧美、日本、中国等众多国家已经规定硝基呋喃类抗生素在所有动物性食品中都被禁止使用。但由于硝基呋喃类药物价格便宜、药效好，在很多国家还在继续使用。2002年3月，欧盟以从我国进口的某些水产品测出呋喃西林等硝基呋喃类药物残留为原由，开始全面停止进口我国动物源性产品，造成大量产品积压和企业停产；2005年11月，日本对中国大陆和台湾省的烤鳗分别检测出硝基呋喃类代
4、谢产物AOZ 超标；2006 年2月，宁波慈溪某进出口公司的27.5 t冻烤鳗由于被检出硝基呋喃类代谢产物AOZ超标，被日本方面全部退回，损失达54.6万美元。因此，加强动物源性产品品中硝基呋喃类药物的检测和控制是一项刻不容缓的工作。但是至今，虽然作为畜禽产品质量安全检测工作重要指标之一，动物组织中硝基呋喃类代谢物残留的快速检测方法标准几乎仍是空白。这远远不能适应目前基层检测机构对家畜家禽初级农产品质量监管的法律法规要求，在具体工作中缺少相关的执行标准。为了能在今后的动物组织产品质量监控的执法工作中有相关的技术依据和技术支撑，急需建立一种快速、灵敏、准确的检测方法，同时又能符合国内动物组织产品
5、质量安全监测需要的标准方法。因此，本标准的建立具有必需性和紧迫性。2、任务来源2.1 针对突发事件紧急制定本方法据韩国中央日报4月19日报道，韩国农林水产检疫检查本部4月18日表示，今年3月份从中国进口的39吨碳烤鸡肉包装产品被查出含有对人体有害的“硝基呋喃（Nitrofuran）”，韩方已要求紧急召回流入市场的8万吨产品。硝基呋喃会引发人体食欲不振、呕吐等症状，多用于治疗家畜家禽的细菌性肠炎和催长剂，已被多个国家禁止。由于硝基呋喃类药物的热和化学不稳定性，常以检测其代谢产物作为残留标示物。为了对畜禽肉制品质量安全进行及时、快速、准确的监测硝基呋喃类药物残留情况，商务部委托由商务部流通产业促进
6、中心起草了本方法。并且在短时间内对北京、天津和河北等省市的畜禽组织进行了抽查和检测。为进一步摸清全国范围内流通畜禽的质量安全，主管部门将动物组织中硝基呋喃类代谢物的检测作为新增的监控指标。2.2 根据实际情况研究表明，人食用残留有硝基呋喃类药物的动物组织后会产生严重的毒副作用，从而直接危害人类的健康。因此，检测动物组织中的硝基呋喃类药物，可对流通环节的畜禽进行监测，对防止有毒生肉在市场上流通具有积极的作用。2.3 方法用于考核和验证方法经过多家科研机构及应用企业的验证考核，用于测定动物组织盲样中硝基呋喃类代谢物残留。方法得到进一步的对照和确证。2.4 今后工作的需要按照起草标准有关规定，起草单
7、位对方法进行了认真的修改和补充完善，完成了3个单位的复核验证，征求了至少30位相关行业领域的专家的意见，对反馈意见进行了认真汇总、吸收和改进，详细起草了编制说明。方法初审稿及相关工作于2012年10月完成。为了进一步完善该方法并能够在今后工作过程中发挥更大的作用，申请成为相关的行业标准。二、主要工作过程动物组织中硝基呋喃类代谢物残留的测定 酶联免疫吸附法该方法标准由商务部流通产业促进中心起草编写。由国家兽药残留基准实验室（华中农业大学）、北京市兽药监察所和北京出入境检验检疫局三家单位进行了方法的复核验证实验，并提交了具体的复核验证报告。根据国家有关标准制定和修订工作的要求，商务部流通产业促进中
8、心在动物组织中硝基呋喃类代谢物残留的测定 酶联免疫吸附法的起草编制过程中，主要工作包括以下几个方面：一是详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，如美国FDA检测方法、动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定、动物组织中硝基呋喃类代谢物的测定方法等国内已申请的相关检验报告。并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。二是及时购置相关的实验试剂、标准品和其他材料；建立了酶联免疫吸附法的反应体系，摸索不同条件对方法进行最优化，最终确定了最佳的检测方法。三是针对动物组织样品与其
9、他参考资料中样品之间的差异，开展多种动物组织酶联免疫吸附法的试验，包括鸡肉、鸡肝、猪肉，这是方法的重要步骤和关键环节。不同样品用同一种方法进行试验和验证，确保本检测方法能够灵敏、特异、准确地检测出动物组织中硝基呋喃类代谢物的含量。如：方法的灵敏度，对20份空白样本进行检测，以检测结果的平均值加上3倍标准差来确定检测限；方法的准确率，通过对0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg三种浓度添加的鸡肉、鸡肝、猪肉样本进行检测，得到本检测方法的回收率，盲样测定与仪器方法的结果进行比对，确保本方法的检测结果可靠；方法的特异性，运用本方法对硝基呋喃类药物及其代谢物进行检测，确保本方法能特异性地
10、检测鸡肉、鸡肝、猪肉中硝基呋喃类代谢物残留。四是在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准样本的格式，起草编写标准文本内容和编制说明内容。五是向相关行业的30多位专家、学者、教授、技术人员、从业人员、管理人员等进行了征求意见。收到意见后尽快参考反馈意见，吸收有益的建议并在方法或文字中进行修改、完善、提高和改正。六是向国家兽药残留基准实验室（华中农业大学）、北京市兽药监察所和北京出入境检验检疫局三家单位提供方法的文稿和编制说明，进行方法的复核验证。三家单位都具有相应的检测机构，并具备很丰富的动物产品中兽药残留、污染物残留检测经验和技术人员。经过复核单位独立、科学和严格的复核验证后，提供了三份复核验
11、证报告。七是在以上工作完成后，组织了该标准方法的初审会议。邀请了国内知名的技术专家和管理部门的专家，召开该标准方法的初步审定。专家在会议上对该方法提出了很多宝贵意见并指出了其中的不足和需要进一步提高的地方。八是根据初审会议及初审专家的意见和建议，起草单位对该标准方法又进行了详细的完善和修改，最终形成了标准的报批稿和编制说明的报批稿。三、标准编制原则和主要技术内容确定的依据1遵循的原则1） 凡是在动物组织中有关硝基呋喃类代谢物的各种要求如储存、检验、质量等标准均作为引用标准或参考标准；2）实事求是，科学客观；3）技术指标达到国内先进，与国际水平接轨；4）保证方法的先进性、稳定性、准确性、灵敏快速
12、和实用性。2 主要技术内容确定的依据技术内容确定的依据：方法的检测限为0.1 g/kg。主要是依据是：我国政府规定的禁止使用，并不得在动物性食品中检出硝基呋喃类代谢物。本方法的检测限，完全能够符合相关部门的要求。方法的准确率、特异性等技术指标确定主要依据：一是农业部农牧发20031号文件“关于发布兽药残留试验技术规范（试行）的通知”中的规定要求。二是按照国际食品法典委员会（CAC）通用要求。其他参数、公式、性能要求、实验方法、检验规则等主要依据包括：GB/T1.1-2009标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则(ISO.IEC Directives,Part3,1997,Rules f
13、or structure and drafting of International Standard, NEQ)；GB/T6682-2008 分析实验室用水规则和实验方法3 标准技术内容和技术指标的论证3.1 呋喃唑酮代谢物（3-氨基-2-噁唑酮，AOZ）3.1.1 酶联免疫吸附法主要材料制备3.1.1.1 人工抗原的合成呋喃唑酮代谢物（AOZ）是小分子物质，不具备免疫原性，只有反应原性，需与大分子载体蛋白共价结合后才能使动物免疫系统识别，产生相应的抗体。本研究先对呋喃唑酮代谢物衍生物小分子进行结构改造获得具有羧基官能团的半抗原，与蛋白质分子中的氨基反应，形成肽键，从而可将半抗原与载体蛋白（
14、BSA、OVA等）偶联制备人工抗原。将呋喃唑酮代谢物衍生物半抗原、载体蛋白以及两者的结合物配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，经过计算分析得到人工抗原的结合比和浓度。NP-AOZ-BSA和NP-AOZ-OVA结合比分别为18:1和14:1，浓度分别为6.9 mg/mL和7.0 mg/mL。3.1.1.2 抗体的制备a） 动物免疫以NP-AOZ-BSA作为免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠（810周龄）。免疫方案如下：首免时，每只小鼠用150 g的NP-AOZ-BSA（以载体蛋白计）与FCA按1:3比例混合制成的乳化剂，颈背部皮下多点注射；二免和三免时，将FCA换成FICA，
15、剂量和方法同上。每次免疫间隔时间为2周。融合前3天每只小鼠腹腔注入100 g NP-AOZ-BSA进行加强免疫。b） 单克隆抗体的制备 三免后第7天，采血清测效价。效价达1.6105以上的小鼠于四免后第12天，摘除眼球放血，并分离阳性血清作对照。无菌操作取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合（比例数8:1）。融合剂为聚乙二醇（PEG）4000，作用2 min，随后即加入20 mL无血清的1640营养液（时间4 min）。离心后，用20 mL完全营养液悬浮混匀。将细胞悬液分别加入已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中（4板），0.1 mL/孔置37 饱和湿度、含5%CO2的培养箱中培养。待细胞长至孔底的
16、1/21/3时，用间接竞争ELISA方法筛选。阳性细胞迅速扩大培养并采用有限稀释法进行亚克隆。1014天后，取细胞上清检测，计算阳性率。阳性率100%时，得到稳定的细胞株。采用体内诱生腹水法进行大量单克隆抗体的制备，将BALB/C小鼠（68周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5 mL/只，10天后，再注入阳性细胞1106个/只，植入细胞后第7天起，每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，用9#针头穿刺腹腔抽取腹水。每只小鼠可采腹水约23 mL/次。离心去脂肪层和细胞层后，用饱和硫酸铵法纯化，分装冻存。阳性细胞经过3次亚克隆，阳性率达90%，得到了3株稳定分泌单克隆抗体的细胞。3.1.2 检测方法的建立3.1.2.1 抗原、抗体的筛选1）用常规包被液（pH9.6，0.05 mo
