动物细胞工程实验指导

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1、实验时间实验内容4月11日实验一培养用液的配制、除菌与分装4月18日实验二细胞的传代培养4月25日实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（1-5组）401 实验四染色体制备（6-10组）3015月2日实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（6-10组）401 实验四染色体制备（1-5组）3015月9日实验五细胞的复苏与冻存实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。2. 掌握常用的灭菌方法。3. 了解每种培养用液的作用。【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培 养基、胰蛋白酶（Tryps

2、in）和EDTA溶液。PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。 培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。鱼类细胞 培养的培养基常用种类是MEM和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。胰蛋 白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。EDTA用 于清洗细胞表面，螯合2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋 白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl，KCl，Na2HPO4, KH2PO4，ED

3、TA，胰蛋白酶，HEPES，碳酸氢钠，盐 酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（68-80），容量瓶（250 mL、1000 mL），移液管（5 mL、10 mL），次性注射器， 一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试 剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4P冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。配制PBS并高压灭菌，配制胰蛋白酶溶

4、液并过滤除菌和分装，配制EDTA溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过滤除菌培养基并分 装。每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL； EDTA 50 mL；培养基90 mL （使用前加 入10 mL血清）。【实验步骤】1. PBS （1000mL）的配制分别称取 NaCl 8g； KCl 0.2g； Na2HPO412H2O 2.9g ； KH2PO40.2g 于烧杯，加入 800 mL三蒸水，玻棒搅动充分溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。PBS 用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高压灭菌备用。2. 胰蛋白酶溶液(0.25% )的配制、除菌与分装称取0.625g

5、胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL,玻棒搅拌充分溶解 后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5 个试剂瓶(100 mL),每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜 封口，放4 C冰箱保存备用。标签上标明：0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长 姓名。3. EDTA (0.2% )的配制、除菌与分装称取0.5 g EDTA于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，溶解时加少量NaHCO3, 调整pH为8.0，玻棒搅拌使EDTA充分溶解。再用PBS定容到250 mL容量瓶里，终浓度 为

6、02%，用浓盐酸，调pH为7.2-7.4。装于250 mL试剂瓶中，高压灭菌备用。在超净工作台内，将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无菌试剂瓶(100 mL)，每瓶50 mL。 试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 C冰箱保存备用。标签 上标明：0.2% EDTA、配制日期、以及组号与组长姓名。4. 培养基的配制、除菌与分装将培养基干粉(MEM或PRMI-1640)倒入1000 mL烧杯，加800mL三蒸水，玻棒搅 拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈橙色(弱 酸性，pH在7.0左右)；再倒入1000 mL容量瓶，用三蒸水定容

7、至刻度。工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯； 带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超 净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。将培养液拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个无菌试剂瓶(100 mL)，每瓶90 mL， 余下装入500 mL无菌试剂瓶，每瓶内需加入无菌的GPS (谷氨酰胺-青霉素-链霉素)，轻 轻摇匀，使之终浓度为1%。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口， 放4 C冰箱保存备用。标签上标明：MEM或PRMI-1640、配制日期、以及组号与组长姓 名。用于细胞培养时，培养基内需要加入血清，生长培

8、养基内血清浓度为10%。【注意事项】1. 滤过除菌时，将容量瓶内的液体倒入烧杯内，再拿到超净台里，采用一次性滤器或是 抽滤法除菌。2. 培养基中的抗生素可在配置时加入青霉素和链霉素的粉末，也可在过滤除菌后加入无 菌的液体，终浓度为100 U/mL青霉素和100 g/m!链霉素。【思考题】1. 配制细胞生长培养液时，需要添加哪些物质，为什么？如何调节培养液的pH?2. 生长培养基中的血清一般在什么时候添加，为什么？3. 细胞培养中的各种试剂的灭菌和除菌方法有哪些，如何使用？实验二细胞的传代培养【实验目的】1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。2. 了解细胞传代培养的意义。【实验原理】细胞在培养

9、瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。贴壁生长细胞在培养瓶中生长数 天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏 营养供给而死亡。因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细 胞，使细胞继续生长。这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。细胞传 代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。传代培养是组织培养常规保种方法之 一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温 度视动物种类而定。一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25-28C，冷水鱼类细胞为 15-20C，水生哺乳动物细胞为37C。细胞培养过

10、程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素， 而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液 来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。单纯换液不需要接 种细胞。【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640或MEM，添加10%小牛血清或胎牛血清），0.25%胰 蛋白酶，0.2% EDTA材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯， 打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心

11、 机，4笆冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯; 带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超 净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。1. 观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时 可以传代；2. 超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台酒精灯左侧；3. 开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，将培养瓶内 液体（旧培养基）倒入15 mL离心管，

12、3000 rpm/min离心5 min备用。培养瓶瓶口、 瓶盖以及离心管管口、管盖均需过酒精灯火焰后再盖好；4. 清洗细胞表面：打开移液管盒，用普镊捏住移液管（5mL）后部从盒子中拖出（注意 移液管的管壁和管口不能碰到其他物品），安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精 灯火焰。酌情吸取2-4 mL EDTA溶液，清洗细胞表面，去掉残留的旧培养基以及漂浮 的死细胞，再倒弃EDTA溶液；5. 胰酶消化：用移液管吸取2 mL胰蛋白酶，从培养瓶侧面加入细胞培养瓶内，盖好瓶 盖后，在倒置显微镜下观察，当80%的细胞收回突起变圆时，立即翻转培养瓶，使细 胞脱离胰酶；6. 中和消化：用移液管吸取旧培养基上清

13、液3 mL （也可用新鲜生长培养基），加入细胞 培养瓶中，终止胰酶消化，并反复轻轻吹打消化好的细胞使其脱离瓶壁并分散；7. 沉淀细胞：将细胞悬液吸入15 mL的离心管中，1000 rpm/min离心8分钟，获得细胞 沉淀；8. 加入新鲜培养基：倒弃上清液，保留细胞沉淀（注意只能倒一次，不能反复倒），然后 用另一新移液管吸取10 mL的新鲜培养基加入培养瓶中5mL，余下5mL加入离心管 内悬浮细胞沉淀，吸取离心管中的细胞悬液加入细胞培养瓶中，与561外培养基混匀；9. 接种细胞：吸取5mL上述的细胞悬液，加入另一个新细胞培养瓶中，接种个培养瓶中 的悬液各5 mL10. 静置培养：盖上瓶盖，拧紧，

14、标记（包括细胞名称、代数、传代日期），放入常规的生 化培养箱静置培养（如果放入2培养箱，瓶盖拧紧后再稍回转）；11. 观察细胞：每天观察细胞生长状况，并确定是否进行第2代的传代。【注意事项】1. 传代培养时要注意无菌操作，所有操作要尽量靠近酒精灯火焰，手不能在瓶口上方操 作，以免污染气体进入瓶内。要防止细胞之间的交叉污染，每次最好只进行一种细胞 的操作，每一种细胞使用一套器材。每种试剂使用一个移液管，培养用液要严格分开。2. 坚持每天观察细胞，生长致密时即可传代。如发现有污染迹象，应丢弃污染的细胞。3. 细胞消化时要注意观察，不要消化过度，否则细胞不宜存活。吹打细胞时，确保瓶壁 所有地方均吹打

15、到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，以防细胞破碎。4. 培养箱不要反复多次开关，以免影响温度的稳定和增加污染的机率。【思考题】1. 贴壁细胞的传代培养方法及注意事项。2. 常用的细胞消化液有哪些？各种消化液的作用原理分别是什么？3. 悬浮生长的细胞如何传代培养？实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）【实验目的】1. 掌握鱼类细胞原代培养的组织块法。2. 了解细胞原代培养的酶消化法和机械分离法。【实验原理】细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养常用方法有组织块法、酶消化法和机械 分离法等。组织块法是直接从生物体获取组织，切割成微小的组织块，然后贴附于培养瓶 底部，通过培养液供给营养，在合适的温度中孵育，让组织块周边慢慢地长出细胞来，经 消化传代，获得大量均一的细胞，用于传代培养和相关细胞实验。【试剂、材料与仪器】试剂：MEM培养基，GPS，两性霉素B，硫酸庆大霉素，表皮生长因子（EGF），成 纤维生长因子（FGF）材料：试验幼鱼，原代培养瓶，无菌培养皿，移液管（5 mL），无菌离心管（15 ml）， 解剖探针，手术剪，眼科剪，眼科镊，手术刀，医用酒精，烧杯250 mL），废液缸，普镊， 酒精灯，打火机，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或。02培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，4C冰箱 【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组，