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1、微量肉汤稀释法测 MIC一、试验原理目的细菌在96孔板MHW养基中生长，过段时间由于量大会产生白色沉淀， 很容 易区别有无菌落生长， 将抑菌剂依次对倍稀释， 加入菌悬液培养一段时间后， 无 沉淀的最后一个空即为 MIC浓度。本试验微量样品即可测出最小抑菌浓度，且 96孔板占地少， 一板可做 96个试验梯度， 适用于大批量的检测试验， 节约时间。二、试验器材、化学试剂及菌种96孔板、试管、5uL-50uL微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配 套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、 生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。菌种：溶血性
2、链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒 状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌三、试验准备1、培养基的配置MH培养基42g,蒸馏水1000ml。灭菌后待用，若一次用不完可放入 4C冰 箱中放置。使用前拿出放置室温即可。2、工器具的灭菌将配置好的 MH 培养基、 PBS 缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高 压灭菌锅中灭菌，121T杀菌25min。试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170C杀 菌 2h。 96 孔板在超洁净工作台上紫外杀菌 30min 以上。2、抑菌剂的配置抗菌药物的溶解与稀释， 一般情况下，水溶性抗菌药物采用灭菌蒸馏水溶解， 而对于不溶或者难溶于水的抗菌药物要根据其特性
3、，采用甲醇，缓冲液， NaOH 溶液， DMSO 溶液等，尽量将抗菌药物溶解后用蒸馏水或者缓冲液稀释后，作 为抗菌药原液。3. 、菌悬液的配置从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后,加入5mL的PBS缓冲液将斜面上， 在手掌上轻轻振打 80 次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。吸取 1mL 的 菌液加入到4mL的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度 稀释，选择108CFU/mL左右的菌悬液或106CFU/mL左右的抱子悬浮液（对比0.5 麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为 106CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的抱子悬浮
4、液），再吸取0.5ml加入到 4.5mlMH 培 养基 中，用枪头吹匀待用。四試验步骡1. 在96孔板每个孔加入MH肉汤培养基100卩l。2. 在A/B/C三排的第一孔加配好的药液100卩l，然后对药物进行二倍稀释。即, 第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打（至少三次以上）使药物与肉汤充分混匀， 然后吸取100卩l加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最 后一孔，第12列吸出100ul扔掉。3. 再在每一孔中加入稀释好的菌液 100卩l,重复做三次（A/B/C三排样品）。4. 在同一块板上的G排上做一排阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液）和在 H排 上做一排阳性对照（加菌液不加药液）。
5、5. 将96孔板放入37C恒温培养箱1620小时后，观察结果。123456789101112A 肉涵4理_ 药AWOful*7ooui-OuH5o5urToOuf菌液100ulB同AffCD 肉汤100ul 药BIOOul 画頑1QQuIE同D排F同D排G阴性对艄H阳性对照五、结果观察记录：1、若有菌生长孔板底部会有白色沉淀。2、MIC值的判定：96孔板上横排中未有沉淀的最后一孔所对应的浓度便为该药的MIC值。3、观察所做的阴性对照和阳性对照结果。4、记录结果并将每种药物的 MIC值。六、注意事项：无菌操作1、除移液枪和 96 孔板外其他所有用具都需经过高压灭菌处理。2、 超净台使用前后都需打开紫外灯进行消毒；不能拿酒精面球球擦挡板。3、操作前洗手，用酒精棉球擦手。4、每次枪头过瓶口，瓶口都要经火焰烧过；移液枪和枪头不能在究竟灯上烤。5、操作过程中加液尽可能不将 96 孔板盖完全打开。
