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1、. .第八章酶的人工模拟hh教学目标了解抗体酶、印迹酶等人工酶模拟酶等新型酶的设计、原理和典型应用。教学重点抗体酶的制备原理和应用；生物印迹酶的原理和应用。教学方法以课堂讲授为主，课前布置学生自学和准备。引入模拟酶就是根据酶的作用原理，模拟酶的活性中心和催化机制，用化学合成方法制成的高效、高选择性、构造比天然酶简单、具有催化活性、稳定性较高的非蛋白质分子的一类新型催化剂，也称酶的合成类似物。或者叫酶模型或者叫人工酶。一、模拟酶的概念1、模拟酶的酶学根底酶的作用机制：过渡态理论对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究2、超分子化学主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补超分子：该
2、分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当承受体与络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定构造和性质的实体，形成超分子。功能：分子识别、催化、选择性输出二、模拟酶的分类和制备根据Kirby分类法：单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成。单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。按照模拟酶的属性：q 主-客体酶模型q 胶束酶模型q 肽酶q 半合成酶q 抗体酶q 分子印迹酶模型2.1 主-客体模型2.2.1 环糊精模拟酶环糊精由淀粉通过环糊精葡萄糖基转移
3、酶降解制得；是由D-吡喃葡萄糖单元以-1，4-糖苷键相互结合成互为椅式构象的环状低聚糖，其分子通常含有612个吡喃葡萄糖单元。有实用意义的是含6、7、8个吡喃葡萄糖单元的、-环糊精，但-环糊精空腔较小，-环糊精价格昂贵，常用的是-环糊精。水解酶的模拟Bender等人将实现了电荷中继系统的酰基酶催化部位引入CD的第二面，成功地制备出人工酶-Benzyme 。催化对叔丁基苯基醋酸酯(p-NPAc)的水解比天然酶快一倍以上；kcat/K m也与天然酶相当。Rama等人将咪唑在N上直接与-CD的C-3相连，所得的模型2催化p-NPAc的水解比天然酶快一个数量级。以二茂铁为结合位点的硝基苯酯(如模型3)
4、，以CD本身为催化剂可加速酯水解达105106倍。核糖核酸酶的模拟牛胰核糖核酸酶：124氨基酸残基；His12, His119, Lys41在它的催化下RNA的磷酸酯水解分两步进展，两个咪唑基交替起着广义酸碱催化的作用。4的催化下水解反响只生成C；5催化水解反响只生成B。环糊精底物复合物的几何形状和催化基团所处的位置对反响的选择性起了决定性的作用。2.2.2冠醚化合物的模拟酶1冠醚定义：分子中具有-CH2CH2On-重复单元的环状醚，1962年首次合成的冠醚形状似皇冠而得名：命名：x冠y：x环上的原子总数，y氧原子数15冠5 日本学者Koga等人采用冠醚为主体，合成了带有巯基的仿酶模型。利用此
5、模型可在分子内实行“准双分子反响以合成多肽。此模型具有结合两个氨基酸的能力。2.2胶束模拟酶模拟水解酶的胶束酶模型：组氨酸的咪唑基常常是水解酶的活性中心必需的催化基团。如将外表活性剂分子上连接上组氨酸残基或咪唑基团上，就有可能形成模拟水解酶的胶束。N-十四酰基组氨酸所形成的胶束催化对硝基苯酚乙酸酯的水解，其催化效率比不能形成胶束的N-乙酰基组氨酸高3300倍。2.3肽酶(pepzyme)肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。设计合成29肽TrPepz模拟了胰蛋白酶的活性部位，在水解2个或2个以上串联的赖氨酸和精氨酸残基的化学键时，TrPepz比胰蛋白酶的活性更强。2.4半合
6、成酶以天然蛋白或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其构造从而形成一种新的“人工酶。通过选择性修饰氨基酸侧链将一种氨基酸侧链化学转化为另一种新的氨基酸侧链称为化学诱变法。Bender等人首次成功地将枯草杆菌蛋白酶活性部位的丝氨酸Ser残基，经苯甲基磺酰氟特异性活化后，再用巯基化合物取代，将丝氨酸转化为半胱氨酸。虽然产生的巯基化枯草杆菌蛋白酶对肽或酯没有水解活力，但能水解高度活化的底物，如硝基苯酯等。Hilvert等人利用类似的方法，将枯草杆菌蛋白酶结合部位的特异性Ser突变为硒代半胱氨酸。此硒化枯草杆菌蛋白酶既表现出转氨酶的活性又表现出含硒谷胱甘肽过氧化物酶活性。2
7、.5抗体酶2.5.1 概念抗体酶又称催化性抗体，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶属性。2.5.2历史1948年Pauling的预言：酶的催化作用是由于酶在催化化学反响过程中，活性中心同底物的过渡态或高能反响中间体产生互补，从而加速化学反响的进展。Jencks1969年的假设：抗体假设能与化学反响的过渡态结合,那么这样的抗体必具有催化性能。以此推理,抗体假设能与过渡态类似物结合,那么它也会与化学反响过程中的过渡态结合,这样的抗体亦具有催化性能。1986年，Lerner和Schultz两个研究小组独立发表了关于芳香酯和碳酸酯的抗体催化水解的报道，首次人工制得抗体酶催化抗体。2.5.
8、3制备原理设计过渡态类似物，作为半抗原结合载体分子免疫动物，得到抗体酶。2.5.4抗体酶的应用在有机合成中的应用：催化天然酶不能催化的反响 催化反响动力学不利的反响 催化立体专一性的反响说明化学反响机制催化抗体在医疗上的应用吸毒(如可卡因和鸦片)是困绕着很多国家的难题，尤其是吸毒上瘾后很难戒毒。直接拮抗可卡因上瘾的拮抗物至今没找到，促进戒毒的药物如desipramine也需要几个星期的诱导才能有效，且效果不理想。一个可替换的方法是阻断可卡因和受体的结合，但是必须使用高剂量药物。Landry等用可卡因降解的过渡态类似物磷酸单酯产生的单克隆抗体3B9催化可卡因降解，此抗体酶的催化活性比血液中分解可
9、卡因的丁酰胆碱酯酶要高，水解后的可卡因片断失去了刺激功能，因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能提供阻断可卡因上瘾的治疗，从而到达戒毒的目的。2.5.5催化抗体研究前景抗体酶筛选催化效率的问题模拟酶的展望模拟酶的研究近年来进展比拟大，但现阶段模似酶无论在催化效率，还是在专一性上都还比拟差，要到达实际应用还要有大的技术和理论突破。但是，最终的结果必定是开展了酶学理论，指导了生产实践。解决了人类遇到的难题，造福了全人类。三、印迹酶3.1分子印迹技术概述3.1.1分子印迹原理分子印迹Molecular imprinting是制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。这个化合物叫印迹分子print mol
10、ecule也叫做模板分子template。功能单体通过与模板分子相互作用聚集在模板分子周围形成某种可逆的复合物功能单体与过量交联剂在致孔剂存在下发生共聚生成高聚物将模板分子从高聚物中解离出来，结果，形成的聚合物内保存有与印迹分子的形状 大小完全一样的孔穴。制备选择性聚合物的过程(a)在印迹分子和交联剂存在下通过光和热启动集合作用(b)形成聚合物研磨聚合物(d)抽提印迹分子(e)得到选择性聚合物MIPM-单体;CR-交联剂;P-印迹分子分子印迹可遵照如下两种方法:1)印迹分子被共价、可逆结合在单体分子上；2)单体与印迹分子之间的最初作用是非共价的。3.1.2用可逆共价结合可得到能拆分糖的外消旋混
11、合物的聚合物印迹分子：苯基D甘露吡喃糖苷单体：两分子乙烯基苯基硼酸交联剂：乙二醇二甲丙烯酸酯存在下发生共聚反响，得到印迹聚合物。经酸水解除掉印迹分子苯基D甘露吡喃糖苷后，那么所得聚合物中留有与印迹分子形状一样的孔穴，孔穴内还带有硼酸基团。由于该聚合物可以可逆的选择性的结合印迹分子，所以可拆分这个糖的外消旋混合物。图6-30苯基D甘露吡喃糖苷作印迹分子，与单体乙烯基苯基硼酸发生作用，形成共价复合物；与共聚后形成印迹聚合物；除掉印迹分子后得，它能可逆的选择性的结合模板分子。图6-31 用图6-30制备的印迹聚合物层析别离模板分子的外消旋混合物3.1.3非共价相互作用制造的聚合物Mosbach等用模
12、板分子的氨基与单体羧基之间的非共价相互作用制造的聚合物可用来根据底物选择性和对映体选择性别离氨基酸衍生物。图6-34利用非共价相互作用的分子印迹。a苯丙氨酰苯胺和丙烯酸之间的离子或其他相互作用决定“印迹部位的形状大小和性质。与交联并抽提模板分子后，该聚合物对苯丙氨酸酰苯胺有选择性。b为在此聚合物层析柱上拆分外消旋的，苯丙氨酰苯胺。3.1.2外表分子印迹无机物为载体的外表印迹：在某些载体外表产生分子印迹空腔或进展外表修饰产生印迹结合部位的过程称为外表分子印迹。 例如在硅胶球外表的分子印迹：首先将3-(三甲氧基硅烷基)甲基丙烯酸通过共价键结合到硅胶外表，引入聚合单体甲基丙烯酸酯，待印迹分子与单体共
13、同包被在硅胶外表后，采用常规的聚合方式聚合，然后去除印迹分子后，就产生了具有一定粒度不溶胀的外表印迹微粒。这种印迹方法特别适于制备拆分对映体的聚合物。固体材料的外表修饰：双西佛碱的二硅氧烷分子与硅胶外表的硅羟基缩合，其他硅羟基用戊基甲基硅烷保护起来以防止产生非特异性吸附作用。待用硼氢化钠复原除去联苯二醛后，就产生了两个有一定距离的氨基。这样的二氨基对恰当长度的二醛具有很好的选择结合能力。 蛋白质的外表印迹：图6-38 蛋白质外表印迹在聚合物涂层的硅石上的示意图3.1.3生物印迹生物印迹(Bioimprinting)是分子印迹的一种形式，它是指以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进
14、展分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。原理：生物分子构象的柔性在无水有机相中被取消，其构象被固定，因而模板分子与生物分子在水溶液中相互作用后产生的构象变化在移入无水有机相后才能得以保持。用酒石酸作用于牛血清白蛋白，然后冻干，再用有机溶剂抽提酒石酸，最后得到酒石酸印迹的牛血清白蛋白。印迹的白蛋白在无水乙酸乙酯溶剂中结合酒石酸的量是未印迹蛋白结合酒石酸的30倍。印迹曲线1和未印迹曲线2白蛋白作用的时间过程曲线(a)无水二异丙醚中结合对羟基苯甲酸;(b)在无水乙酸乙酯中结合L-酒石酸3.2分子印迹酶通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，更重要的是利用此技术可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。3.2.1印迹底物及其类似物Mosbach等人应用分子印迹法制备具有催化二肽合成能力的分子印迹酶。印迹分子：分别以底物混合物(Z-L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸1:1混合)以及产物二肽为印迹分子。单体：甲基丙烯酸甲酯为聚合单体，交联剂：二乙撑甲基丙烯酸甲酯为交联剂经聚合产生了具有催化二肽合成能力的二肽合成酶。研究说明以产物为印迹分子的印迹聚合物表现出
