植物切片制作

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1、叮叮小文库植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术， 是人们认识植物体结构的有 效手段， 已成为植物生物学的重要组成部分。 植物制片技术已建立了许多方法， 现简要介绍 如下几种最常见的制片技术：徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡制片法和冰 冻切片法。徒手切片法徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片， 所作的切片通常不经染色或经简单 染色后，制成临时的水装片用于观察，亦可以通过脱水与染色制成永久制片。优点：简单、 方便，不需要复杂的设备，不经过化学药物的处理，基本上保留了植物活体的状态。 用品与材料显微镜、载（盖）玻片、刀片、毛笔、培养皿、吸水滤纸、滴管、ddH2O 或

2、清水、 1%番红水溶液、菜叶、胡萝卜、马铃薯 实验材料 对于软硬适中，便于手持的材料， 可将实验材料截成适当小块， 一般以长 23cm， 切片断面不超过 35mm2 为宜。对于过于柔嫩的器官（如叶片等） ，一般可选用胡萝卜根、 土豆块茎等作为支撑物， 包被住材料后再进行切片。 有时也可将叶片卷成圆筒后再进行切片。 实验步骤1、在小培养皿中放入 ddH 2 O 或清水。2、用左手拇指、食指和中指拿住材料，拇指略低于食指与中指，并使材料略为突出在指尖 上面。3、右手持刀，将刀片平稳地放在左手食指之上，与材料切面平行，然后以均匀的动作，自 左前方向右后方，斜着向后拉切，切时用臂力而不用腕力。4、切下

3、许多薄片后，用湿毛笔将这些薄片放人培养皿中。用毛笔挑选透明的薄片，放在载 玻片上，用吸管滴一滴水在载玻片上，盖上盖玻片，制成临时装片进行观察。注意事项1、在切片前，要不断地用水湿润材料和刀片。2、切片时，两只手应该保持活动状态，不要使它们紧靠身体或实验台，且用力不要过猛， 不能用刀片挤压材料或来回切割材料。3、动作要敏捷，材料要一次切下，不要追求切片形状的完整。简单的组织化学染色经徒手切片法切下的薄片， 可以进行简单的组织化学染色， 这样更容易分辨细胞的结构， 同时可以观察到细胞各部分的化学成分。一般选用以下几种染料进行染色：1、1番红水溶液 木质化、栓质化的细胞壁及细胞核染成红色。2、25硫

4、堇水溶液组织呈现从粉红到蓝紫的多色反应，区分含纤维素、木质素的细胞壁。3、5%间苯三酚反应木质化的细胞壁成红色，颜色深浅与木质化程度有关。4、I2KI 染色淀粉粒呈蓝色，细胞核呈黄色。视课上实验进展情况，另外安排显微镜下观察动植物组织装片。压片法（简要介绍，补充实验 洋葱根尖有丝分裂染色体标本制备及观察 ）压片法是植物的器官或组织未经处理或经过处理后，被涂抹或压在载玻片上， 使细胞成一薄层，便于进行观察的一种制片方法。压片法的实验步骤包括：取材、预处理、固定、解离、染色、压片、镜检和制成永久制片等。实验步骤1取材：用锋利的双面刀片截取生长良好的植物根尖或茎尖，长度不超过3mm。2、预处理：利用

5、预处理液如秋水仙素、对二氯苯等处理材料，使细胞分裂停留在有丝分裂的中期，并使染色体缩短变粗。 预处理的时间视不同植物而定。观察有丝分裂各期特点和减数分裂的幼小花药的制片不需要预处理。3、固定：用固定剂迅速杀死正在分裂的细胞，使其尽量保持分裂的状态。常用的固定剂是卡诺固定剂，固定时间l24h。4、解离：用酶或盐酸处理固定后的材料，使正在分裂的细胞分离，便于压片。解离时要掌 握好时间，特别是用盐酸解离时，时间过短，细胞不易分开；时间过长，则染色困难。5、染色：常用碱性品红或醋酸洋红等染核的染料进行染色。6、压片：压片时，将新鲜的或经固定的材料放在载玻片上，用解剖刀或镊子后端压住材料， 并往载玻片的

6、另一边拖，注意用力均匀。也可以将载玻片上的材料盖上盖玻片，用解剖针、竹毛衣针或铅笔轻轻敲击，使组织或细胞分散，再用拇指挤压盖玻片，使细胞成一薄层。前者常用于花粉和小孢子母细胞，后者用于根尖、茎尖和幼叶等幼嫩器官。7、镜检：将压片置于显微镜下观察，选取目标细胞。用记号笔在载玻片和盖玻片上分别作 记号。8、照相或制成永久制片：好的压片可以直接照相，也可以通过冷冻干燥后制成永久制片。滑走切片法（补充）滑走切片法是利用滑走切片机切新鲜的或保存的材料，亦可以切经由石蜡制片法包埋的材料。此法切出的切片厚薄均匀、结构完整，适用于一些比较坚硬的材料。用品和材料实验用品 显微镜、滑走切片机、切片刀、载玻片、盖玻

7、片、双面刀片、毛笔、培养皿、滤纸、滴管和软木。实验材料 新鲜材料，若直径小于 lcm，可分割成3cm长的小段；若大于lcm，则应将材 料劈开，使切面的面积小于lcm2为宜。新鲜材料可直接用于切片，也可以经处理后再进行切片。处理时，用 FAA固定液固定一天，然后转入软化剂如甘油、氢氟酸中软化，软化时 间视不同材料而定。 在木材制片时，也可以用水煮法排出木材中的空气并软化部分组织，然后转入软化剂乙二胺中，软化合适后，用聚乙二醇包埋。 经由石蜡制片法包埋的材料也可以利用滑走切片法切片。实验步骤滑走切片机由机身、升降夹物装置、切片刀的夹刀滑行部分等组成。先把切片刀固定在夹刀上，然后将材料固定在两片软木

8、中，材料露出木片约0.5c m,再固定在切片机的夹物装置上。调好材料的高度，使刀刃靠近材料的切面，并使材料与刀刃平行。调整厚度调节器， 使其符合切片的要求。切片时用右手扶切片刀的夹刀滑行部分，均匀用力往自己方向移动， 切片便被切下并粘在刀的表面上。用湿毛笔把切片取下，放入盛水的培养皿里， 然后把刀推回。当把刀向后推时，夹物装置就按调节好的厚度上升。如此循环往复。可将切片制成临时装片或进行简单的显微化学染色后观察，亦可以通过固定、脱水、染色和封固等程序，制成永久制片。离析法（补充）离析法是用一些化学药品使细胞间的胞间层溶解，细胞彼此分离，从而得到单个、完整细胞的方法，便于研究细胞的立体结构。1、

9、 铬酸-硝酸离析法 适用于木质化组织，如木材、纤维等。把材料切成长约lcm、火柴棒 大小的小条，放人小玻璃管中，加入离析液，其量约为材料的20倍。盖紧瓶盖放在3040 C 的温箱中。离析的时间，一般12天。如果2天后仍末离析，可换新的离析液，再放置几天， 时间因材料的性质而异。 检查材料是否离析， 可取出材料少许，放在载玻片上，用解剖针末 端轻轻敲打，若材料分离，表明离析时间已够。这时移去离析液，用水清洗干净，保存在50%或70%的酒精中备用。2、 盐酸-草酸铵离析法 适用于草本植物的髓、薄壁组织和叶肉组织等。把材料切成小块，约lcm x 0.5cm x 0.2cm大小，放入3:1的70%或9

10、0%酒精和浓盐酸中。若材料有空气，应 抽气，抽气后更换一次离析液。24h后，用水清洗干净。放入 0.5%草酸铵水溶液中，时间的长短视材料的性质而定。可以每隔12天作检查。其余与上法相同。石蜡切片法（补充）石蜡切片法是用石蜡作为包埋剂的一种显微制片方法，是显微技术中最重要最常用的方法之一。它的优点是能够切出薄而均匀的连续切片，便于进行器官的三维重构。此法多用手摇切片机切片。对于较硬的材料，也可以使用滑走切片机。石蜡切片法的操作程序包括：取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、粘片、染色和封片。实验步骤1、取材：选取生长良好、有代表性的目标材料，洗净。用锋利的双面刀片截取材料，动作要迅速。

11、材料的大小不超过 0.5lcm3。2、 固定：将选取的材料放人固定液中，固定液的体积大约是材料的20倍。固定是用化学试剂迅速杀死细胞的过程。目的是尽可能使细胞中的各个组分保持生活状态的结构，并固定在#叮叮小文库它们原来的位置上。常用的固定剂有FAA、卡诺和纳瓦兴固定液。前两种固定液的固定时间是224h，后者是1248h。FAA既是良好的固定剂，也是保存剂，材料可以在其中长久 保存。而卡诺固定液和纳瓦兴固定液则不能长久保留材料，固定后，应尽快清洗，转人70%酒精中保存。若材料含有空气，固定时需要抽气。3、 脱水：固定好的材料经各级酒精脱水至纯酒精。各级酒精的浓度为：30%、50%、70%、 85

12、%、95% 和 100%。4、透明：纯酒精中的植物材料用 1/2纯酒精和1/2二甲苯混合液处理 23h，转入纯二甲苯中，处理两次。由于石蜡溶于二甲苯而不溶于酒精，因此透明的作用除了使材料变得透明外，另一方面是将材料中的酒精除去。5、浸蜡：使石蜡慢慢溶于透明剂中，然后完全取代透明剂进人植物组织中。一般将透明好的材料换入新的二甲苯中，然后加入等体积的碎蜡，置于40C左右的温箱中。随着碎蜡的溶解，不断加入碎蜡使石蜡饱和为止。时间大约l2天。6、 包埋：浸蜡后，在 60 C的温箱中，换两次已溶解的纯蜡，每次约2ho然后将材料和石蜡一起倒人小纸盒中，用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐

13、，再将小纸盒平放于冷水中，使其很快凝固。7、修块：将包埋好的材料切割成小块，每个小块包含一个材料。然后按需要的切面将蜡块切成梯形，切面在梯形的上部， 注意上部矩形的对边平行。梯形的底部用烧热的蜡铲将其固定在木块上。8、切片：用手摇切片机将蜡块切成连续的蜡带。切片时，把切片刀夹在刀架上，再把木块夹在固定装置上，调整固着位置，使材料的切与面刀口平行。然后调整厚度，转动切片机切片。9、粘片：粘片是将切好的蜡片粘在载玻片上。在洁净的载玻片上，加少许粘贴剂并涂匀。然后加几滴3%福尔马林或蒸馏水，用解剖针或镊子轻轻将蜡片放在液面上。再将带有蜡片 的载玻片放在温台上，温台的温度在45 C左右，蜡片受热后慢慢

14、伸直。用滤纸吸去多余液体，表面烤干后，转入 30 C温箱放置一昼夜。10、染色和封片：切片干燥后，可以选用不同的染色法染色。染色前先要进行脱蜡，使材料内外的石蜡溶解。然后根据配制染液的溶液情况，决定是否需要复水。 下面以植物生物学中最常见的番红-固绿染色方法，说明染色与制片过程。冰冻切片法（补充）冰冻切片的种类较多， 有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。低温恒冷箱冰冻切片法目前应用得比较多。实验步骤1、取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整。2、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的 应先取一

15、支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。3、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。4、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在 510um间。5、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。 切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板 间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。 这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即 可。6、 应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低， 主要根据不同的组织而定， 不能一概而论。注意事项1、防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。2、多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编