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1、免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法（double immu nofluoresce neelabeli ng method） 也分为直接法和间接法。服务说明冰冻切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次,每次5min。2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶 K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织, 37度温箱孵育30min。将玻片置于 PB
2、S（ PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗 涤3次，每次5min。3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（ PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min4、 加试剂1,2 :按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 （TdT）和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。5、 BSA封闭:将玻片置于PBS（ PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3次， 每次 5min ，在圈内滴加 用 3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭 30min。6
3、、加一抗： 轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗， 切片平放于湿盒内4 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、 加二抗：玻片置于PBS（ PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的 二抗 覆盖组织， 避光室温 孵育 50min 。8 DAPI复染细胞核：切片用PBS（ PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS 后在圈内滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 10min。9、封片： 玻片置于 PBS （PH7.4） 中在脱色摇床上晃动洗涤 3次，每次5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。10、镜检拍照
4、： 切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。 （紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm; FITC绿光激发波长465-495nm， 发射波长 515-555 nm； CY3 红光激发波长 510-560，发射波长 590nm）石蜡切片 荧光tunel+免疫荧光双标 实验步骤1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯 I 15-20mi n-二甲苯n 15- 20min-无水乙醇I 10min-无水乙醇n 10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。2、修复： 切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防
5、止液体流走），在圈内滴加蛋白酶 K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织,37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。3、破膜： 切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。4、 加试剂 1,2：按片子数量和组织大小取tunel 试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿 盒内，37C恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。5、 BSA封闭:将玻片置于PBS ( PH7
6、.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温圭寸闭30min。6、 加一抗： 轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS 按一定比例配好的一抗， 切片平放于湿盒内 4C 孵育过夜。 (湿盒内加少量水防止抗体蒸发)7、 加二抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3次，每 次 5min 。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的 二抗 覆盖组织， 避光室温 孵育 50min。8 DAPI复染细胞核： 切片用PBS ( PH7.4)洗涤3次，每次5min。去除 PBS后在圈内滴加 DAPI染液，避光室温孵育10min。9、封片： 玻片置于 PBS(PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。10、镜检拍照： 切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm; FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长 515-555 nm； CY3 红光激发波长 510-560，发射波长 590nm)注意事项1荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4C保存4h,时间过 长，可能会使荧光提前衰退。2、每次试验均需设置以下三种对照：(1)阳性对照：阳性血清+荧光标记物；阴性对照：阴性血清+荧光标记物；(3)荧光标记物对照：PBS荧光标记物。
