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1、A549细胞的培养A549细胞为人肺腺癌细胞,属于传代细胞系,可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后,加入生长液稀释,以1:21:3传代培养都是可行的。一、 所需溶液1, 细胞冲洗液:磷酸盐缓冲液(PBS)无Ca、MgNACL 8.00g;KCL 0.20g;KH2PO4 0.20g;Na2HPO4 .。12H2O 1.15g加水至 1 000mL,将PH调至7.4,高压灭菌。2, 消化液(1) 胰酶-PBS结晶胰酶 2.5g;高压灭菌后的PBS 1000ml用磁力搅拌器搅拌均匀,使其完全溶解,通过0.22m的滤膜过滤除菌,分装备用,放置20保存。(2) 胰酶EDTA:结晶胰酶 0.5g;EDTA
2、盐溶液 0.2g无Ca、Mg PBS 1 000ml用磁力搅拌器搅拌均匀,使其完全溶解,通过0.22m的滤膜过滤除菌,分装备用,放置推荐精选20保存。3, 细胞培养液:RPMI 1640培养液配制方法:(1) 将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900ml三蒸水中,冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。(2) 加入丙酮酸钠 0.1g,NaHCO2 2g以及双抗,加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100U/ML 青霉素和100U/ML链霉素。(一般市售的青霉素为80 万 U/瓶,将其溶解于4ml三蒸水中,每升培养液中加入0.5ml;市售的链霉素为100 万 U/瓶,将其溶解
3、于5ml三蒸水中,每升培养液中加入0.5ml)。(3) 调整培养液的值,用精密试纸观察.即可。(4) 过滤法除菌,所使用的滤器为加压过滤,.滤膜,滤膜事先采用高压灭菌消毒。(5) 分装,加盖瓶塞,加封纱布报纸,用绳固定,放置20保存。二、细胞的维持和培养, 细胞的复苏() 准备一个盛有温水的烧杯,从液氮罐中取出存有细胞的冻存管,放于温水中,用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。推荐精选() 1000000 r,3min离心。() 在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管,然后打开冻存管,注意动作要轻柔。() 用1ml枪头将上清液去除,加入1ml预热的细胞培养液将细胞吹散开,转移至25cm2培养瓶
4、中。() 补充4ml的RPMI 1640培养基,并且添加10%的胎牛血清。() 倒置显微镜下观察,37、5%CO2培养。() 24h后,更换新的培养液。() 常规传代培养。, A549细胞更换新的培养液() 无菌操作打开培养瓶瓶盖,倒掉培养液。() 用PBS反复冲洗细胞23遍。() 加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。各种液体需要量(ml)表面积 25cm2 75cm2 150cm2洗涤 3 5 10胰酶 12 13 25培养液 5 10 20() 倒置显微镜下观察,37、5%CO2培养。, A549细胞的传代() 无菌操作打开培养瓶瓶盖,倒掉培养液。推荐精选() 向已经长满的细胞中加
5、入消化液1ml,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有的细胞表面,吸弃或倒掉,轻轻冲洗细胞表面2遍,以尽可能去除原培养液中的牛血清。() 加入1ml消化液,在37培养箱中孵育5min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察,发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后,立即终止消化。 () 加入5ml预热至37的培养液,用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行,从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有的底部都被吹到。() 吸取一半的细胞悬液,接种到新的25cm2培养瓶中,补足培养液,并且添加10%20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为510ml。() 倒置显微镜下观察,37、5%CO2培养。注意事项:() 所有
6、液体在加入细胞瓶前均应预热到37。所有液体均应调整PH至7.2左右,均不能超过7.4。() 细胞消化传代时吹打不要产生气泡,吹打力量不宜过多,否则会损伤细胞。() 严格执行无菌操作的要求。() 尽可能减少消化液剩余量,过多时会对细胞产生损伤,可多添加些含牛血清的培养液中和。() 培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。推荐精选, A549细胞的冻存() 消化已生长融合的单层细胞。() 用生长液悬浮细胞,并且添加10%的FCS和10%DMSO(二甲基亚砜)。分装在2ml容积的冻存管中。() 用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管,放在-70冰箱中过夜。() 放入液氮中冻存。()()() () (注:可编辑下载,若有不当之处,请指正,谢谢!)()()() () ()()推荐精选