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1、广州大学化学化工学院本科学生综合性、设计性实验报告实验课程食品微生物实验实验项目 大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测 定专业食品科学与工程班级食品131学号姓名郭小平指导教师刘鹏开课学期2015学年第一学期 时间2015 年5月 25日一、实验方案设计实验序号5实验项目大肠杆菌生长曲线的测定实验时间2015.5.25实验室生化楼327小组成员郭小平、梁永强一实验目的1.通过对大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定，综合训练微生物实验的基本实验技能。 2巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板3. 学习用比浊法测定细菌的生长曲线。4. 比较不同培养基的生长曲线。二实验原理、实验流程或装置
2、示意图、实验原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量， 以菌量的数量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液 体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、生长期、稳定期和衰亡 期。将每一种一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和 衰亡期四个阶段。延迟期：又叫调整期。细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期 曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少延迟期长短因素种、接种菌
3、量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为14小时。 此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。对数生长期：又称指数期。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至 几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感， 因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。稳定期：该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大细菌浓度达到最大即环境最大容纳量。由 于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、过氧化物等）积累PH下降等不利因素的影响，细菌繁殖
4、速度渐趋下降， 相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生 相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽抱等。衰亡期：随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变 长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲 线。掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的
5、不同而有所不同。因此通过测定微生物的生长曲线，可 了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验用比浊法测定，由于细菌悬液的浓 度与光密度（0D值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的0D值与其 对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。（2）、实验流程1、设计实验方案：影响微生物生长的因素有：培养基中各组分的比例、菌悬液的加入量等，由此 设计实验。2、设计正交表：因素酵母育蛋白淼NaCI装载屋丘1_实验10.4鬼0.80.820终止培养、测量OD值
6、养、较各组生长曲线的差异、根据生长曲线的最终结果分析正交表，得出最佳的培养参数。实验20.4U膨0.925实验M0.41龛1毬30实验40.5毬0.80.9毬30实验50.5老0.膨1毬20实验60.51鬼0.825实验70.60.81鬼25尹实验桑作：根据鬆方案配制培养基、灭菌、转爲悬液、培4、数据处理：比5、撰写报告：撰写实验报告，并进行讨论：培养基中各组分的作用，及其对大肠杆菌生长的影响。三.实验设备及材料大肠杆菌斜面菌种、营养肉汤培养基、生理盐水0.85%NaCl） 50mL、721型分光光度计、比色皿、恒温摇床、培养箱、 高压蒸汽灭菌锅、电子天平、酒精灯、电炉、接种环、试管架、锥形瓶
7、9个（250mL）、无菌吸管、烧杯（1000mL）、乳 胶头、报纸、胶塞、玻璃棒等四实验方法步骤及注意事项实验步骤：配制营养肉汤培养基营养肉汤培养基灭菌己制大肠杆菌菌液标记种 培养测定绘制生长碗1. 配制营养肉汤培养基:用电子天平称取1.0g酵母膏、蛋白胨1.8g和食盐2g置于1000mL烧杯中，加水至200mL，用电炉加热（加热过程中要用玻璃棒不断搅拌）至沸腾后，冷却少许后分别倒进10个锥形瓶中， 每个锥形瓶倒20mL，塞上胶塞，用报纸包好，棉绳系好。2. 营养肉汤培养基灭菌:将步骤一包好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅121C灭菌30min.3标记:将9个锥形瓶进行标记，分别标号1、2、38、9
8、、10，并标记时间为2h，4h, 6h, 8h, 14.5h, 16h，18h， 20h， 24ho4接种:用1mL无菌移液管分别移取1mL大肠杆菌菌液到已编号的9个锥形瓶中，并充分震荡均匀.5.培养:将锥形瓶置于37C下在恒温摇床上培养（180r/min）。然后分别按对应时间将锥形瓶取出，待培养结束时测定 0D值。7. 测定:将培养的大肠菌群菌液用无菌移液管移取到比色皿中，选用600nm分光光度计上调节零点，用蒸馏水作为空白对照，并对不同时间培养液从0起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用自来水适当稀释后测定，使其OD值在 0.1-0.65之间，经稀释后测得的OD值要乘于稀释倍数，才是培养液实际
9、的OD值。8. 绘制生长曲线:对所得数据进行生长曲线的绘制，分析实验结果。五实验数据处理方法与原始记录实验数据处理方法：以时间为横坐标，0D60为纵坐标，用excel绘制大肠杆菌的生长曲线，分析实验结果。实验数据原始记录：分组12345678910时间2h4h6h8h14.5h16h18h20h24h空白0D6400.0460.1970.3080.4500.5790.5980.6260.6360.650.032大肠杆菌的生长曲线图+系歹列1时间h24h大肠杆菌OD值实验第一次 实验第二次 实验第三次平均0D值 稀释后OD值0.7910.5870.5030.8030.650.3760.939/0
10、.8641.0130.720.6150.9250.651.271.1970.9980.7980.8430.720.7010.8780.64/0.8820.6760.6060.8690.650.8231.0680.9980.8311.7641.3521.2121.7381.31.6462.1361.9961.662正交实验表实验组分酵母膏蛋白胨NaCl111121223133421252236231731383219332六参考文献1 .周德庆，胡宝龙微生物学实验教程.第2版.北京：高等教育出版社，2006.2 .杨革微生物学实验教程.第2版.北京：科学出版社，2010.3 .何国庆，贾英民，丁
11、立孝等.食品微生物学.第2版.北京：中国农业大学出版社，2009.二、实验报告1实验现象与结果实验现象：随着培养时间的增加，培养基里的液体变得越来越混浊，所散发出来的味道也越来越浓，味道很难闻。实验结果：大肠杆菌在培养基里生长繁殖，数量越来越多，达到一定数量后，增长速度变慢，后大肠杆菌进行营 养和空间的竞争，有些大肠杆菌死亡，最后数量不断减少，直至变为0。2.对实验现象、实验结果的分析及其结论分析： 随着培养时间的增加，培养基里的液体变得越来越混浊，所散发出来的味道也越来越浓，味道 很难闻，是因为大肠杆菌增长迅速，后来数量达到顶峰，此时培养基内的营养物质已被消耗殆尽， 大肠杆菌进行营养和空间的
12、竞争，有些大肠杆菌死亡，最后数量不断减少，直至变为0。 通过对大肠杆菌生长曲线的测定，了解了细菌生长的特点，是刚开始时细菌缓慢增长，后来增 长迅速，呈“J”型，最后细菌生长缓慢，数量达到顶峰，在一段时间内保持不变。因实验测量的时间不够合理等各种因素，因此用原始数据绘制出来的大肠杆菌的生长曲线图不够有 规律，经修正后生长曲线比较好。结论：细菌的生长曲线分为延缓期、生长期、稳定期和衰亡期。体内及自然界细菌的生长繁殖受机体 免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长 规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。这4个时期的长短因菌种的遗传
13、性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生 物的生长曲线，可了解细菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。三. 实验总结1本次实验成败及其原因分析总的来说，本实验算是成功的。在一定程度生探讨出了大肠杆菌生长曲线的测定。通过此次试实验, 了解了细菌生长的特点，综合训练了微生物实验的基本实验技能。巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包 扎、倒平板。在一定程度上掌握了用比浊法测定细菌的生长曲线的方法。但有两点不足:一是一开始忽略了 0D值必须在0.10-0.65之间才有效;二是时间的间隔不太合理，开 始的阶段应该时间安排紧密一点，还有晚上的一段数据没有测，实验时间不够长，延迟期和衰亡
14、期曲线 不明显。实验中若能考虑全面，这样测出来的数据才更有代表性，更加准确。2本实验的关键环节及改进措施本试验的关键环节有以下四点： 整个过程最好是在无菌操作台上操作，这样培养基受空气中微生物的影响就较小，同时也可以减少污 染，保证培养基里大肠杆菌纯度较高，否则会在一定程度上影响结果的准确性。 每隔半小时或一个小时（测量时间要安排合理，时间要控制好:在实验初期30min对菌悬液进行一次测 定。实验中期每小时测一次，后期12小时测定一次，依次持续到20小时后。）从恒温摇床取出锥 形瓶，用无菌移液管移取少量，操作要快，先进行预测，0D值应在0.10-0.65之间，如果超过这个 范围则需要进行稀释后再测量。 测量时要等数字变化不大时再读取，可以读三次，最后取平均值，这样能保证实验结果更加准确。 721型分光光度计要先预热，实验过程中最好使用同一台仪器，同一个比色皿，这样可以减少仪器误 差，分光光度计的使用操作要规范。比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品润洗。比色皿的毛面用 吸水纸擦干，而光面只能用吸水
