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1、多角度激光光散射与凝胶渗透色谱仪联接与应用技术MALLS/GPC(SEC)WYATTTECHNOLOGYCORPORTION(BEIJINGOFFICE)地址：北京西直门北大街58号金晖嘉园7-2302美国怀雅特技术公司北京代表处邮编：100082电话：8610-82292806传真：8610-82290337多角度激光光散射与凝胶渗透色谱仪的联接与应用WYATTTECHNOLOGYCORPORATION.一前言近十几年来，光散射技术(Lightscattering)在高分子特征分析领域的应用得到了迅速的发展。将光散射技术和凝胶渗透色谱(GelPermeationChromatography,
2、GPC或尺寸排阻色谱(SizeExclusionChromatography)分离技术相结合，不但可以测得大分子的绝对分子量，分子旋转半径与第二维里系数，还可测得分子量分布，分辨分子量大小不同的族群以及分子的形状，分枝率及聚集态等。目前，该技术已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲已广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。二光散射简介早在十九世纪初，人们就开始对光散射原理进行研究。自六十年代激光被发明以来，光散射的原理与技术便得以迅速发展，至今已成为检测微小粒子形状，粒径大小，分子量，界面电位及粒子间效应的重要工具。随着电脑技术的日新月异，许多过去需花费数小时甚至数日才能完成的实验，如今只
3、需数分钟即可完成，而其准确性及重现性也大幅度提高了。光散射现象，如图1所示，当一束光通过一间充满烟雾的房间就会产生散射。利用在不同角度，不同时间所测得的光散射强度，再借助各种光学理论及软件，硬件设备，就可以测得微粒的许多特性。入射光散射光图1光散射现象在光散射发展的历程中，以下是一些具有代表性的人物: JamesClerkMaxwell(1833-1879) 解释了光是一种电磁波，并正确地计算出光的速度LordRayleigh(1842-1919)研究了远小于波长的微粒散射现象，发现了散射强度与波长的四次方成反比，并解释了蓝天被太阳光穿透大气层所产生的散射现象。 AbertEinstein(1
4、879-1955)研究了液体的光散射现象。 ChandrasekharaRaman(1888-1970)印度籍物理大师，提出了Raman效应，其著作多次发表于印度文期刊，直至第二次世界大战结束后才逐渐被人所知。PeterDebye(1884-1966)延续了Einstein的理论，描述了分子溶解于溶剂中所产生的光散射现象，提出用Debyeplot,求得重量平均分子量Mw。三光散射理论激光照射到样品时，会在各个方向产生散射光，于是我们可以在一个角度或多个角度收集散射光的强度。1. 光散射所透露的信息在任何方向的光散射强度与分子量和溶液的浓度成正比；散射光角度的变化与分子的尺寸大小有关。当分子小于
5、10nm时，各个角度的散射强度都相同；当分子介于10至30nm时，散射强度则由低角度向高角度呈直线下降的趋势；而当分子大于30nm时，散射强度则随角度增大呈曲线下降的趋势。2. 基本理论由Maxwell，Einstein，Debye及Zimm等人陆续发展起来，有关溶剂中分子量的光散射现象可由下列公式表达：K*c1=+2A2CR()MwP(1)式中：常数K=4n2(dn/dc)2no2(NAX)4)no是溶剂的折光指数。C是溶质分子的浓度(g/mol)。Na是阿佛加德罗常数。X0是入射光的波长。DN/DC是溶液折射率与浓度变化的比值，它说明了随溶质浓度变化的溶液折光指数变化。R()是单个角度的散
6、射光(大于溶剂的散射光数量)除以入射光强度所得的分数即不同角度光散射强度。Mw是重均分子量。A是第二维里系数P(是光散射强度的函数将P(代入式()展开得:在上式中，R()是测得值，K*c、入、为输入值，均为已知值；而MwA、rg为未知值。3. ZimmPlot将K*C/Ro对sin2(q/2)+kc作图，可得到著名的Zimm曲线，如图2所示，其中K为调整横坐标的设定值。sin2(O/2)+kc图2ZimmPlo当B-O时，(2)式简化为斜率即是Ak*R(0)=+2A2C当C-0时，(2)式简化为斜率是rg2当0-0,C-0，(2)式简化为K*1_R(0)M在纵座标上交点的倒数即为Mw实验的方法
7、为配制一组不同浓度的溶液，依次在不同的角度测量其散射光强度，由计算机程序按照上列的公式绘出ZimmPlot，并求得Mw及A2值，这是极少数能直接测得绝对分子量的方法之一。但由于结果仅为单一平均值，因此较适用于成分单一，分布较窄的分子，对于分布较宽或有不同族群分布的样品，则较难看出全貌。四光散射与GPC/SECGPC/SEC可以将溶剂中的分子按重量或尺寸大小依次洗脱出来。利用此项技术将光散射仪器与GPC/SEC联用，除了可以分出不同的族裙，还可测得不同族群的分布,并且不需要另外标准样品做标准曲线。由于光散射信号直接与分子量大小有关，因此可以直接测出重均绝对分子量，并获得其它许多有关的信息。Vol
8、ume(mL)2.0图4光散射强度与GPC层析图nrcpreDvnwyChromatographywithLSSet-upPumpGOFilterInjectorColumnsDAWN-EOSorminiDAWNoptiiftb-nsrUVDetector(Optional)RlDetectorWasteoptiiftb-nsrUVDetector(Optional)口iliDTOiTi口ComputerPlumbingElectrical图5光散射强度与GPC/SEC联用1Debyeplot通常GPC/SEC的样品注射浓度就很低，再经过色谱柱得到进一步的稀释，图4中光散射信号上的任何一点，其
9、浓度都极低(趋近于零)。根据公式，当2A2C-0,1.00x10-68.00x10-76.00x10-74.00x10-72.00x10-70.000.20.40.60.8将K*C/Ro对sin2(q/2)+kc作图6,其纵坐标交点即为1/Mw，由直线的斜率可得到rg2，图4光散射信号的每点都可以得到上述结果，由此可以求得分子量及旋转半径rg2的分布，如图7所示：sin?theta/2)1.090?&AUXdetectors0.0Peak,Slice:1,184Volume:13.067mLFitdegree:1Cone.:(1.488?0.006)e-5g/mLMw:(6.505?0.088
10、)e+6g/molRadius:158.8?0.5nm图6Debyeplot*HEPARIN2MolarMassvs.Volume1.0x16oELATssaMrQKOMI.OxlB8.54o9.0Volume(mL)10.5图7分子量对洗脱体积作图CumulativeMolarMass* LT1LT2LT3LT48642clo.o.o弓0102亠1S.glEFIEc?0.01.0X1031.0X10I1.0x10s1.0X10l.oxio7MolarMass(g/mol)图8积分分子量2分子形状不论是分布较宽或是多峰分布的样品，皆可通过测量分子量及分子旋转半径得到分子形状的数据。球形分子ri
11、3xMilog门=k+1/3logMi无规则线团状分子ri2xMilog门=k+1/2logMi棒状分子ri1xMilogri=k+1/1logMi将logri,logMi作图，有直线的斜率可以获知分子的形状，如图9所示:)图9-1M、巾与分子形状的关系100.010.01.0x1041.0x1051.0x1061.0x10RMSRadiusvs.MolarMassGATC2011000.00.54?0.01MolarMass(g/mol)图9-2构型判断，rg对Mw作图。斜率为o表明分子是具有无规则线团构象的线性聚合物SMRMolarMass(g/mol)构型判断，rg对Mw作图。斜率大于0
12、.6，表明分子具有伸展结构。斜率为1.0，表明是棒状O100.0SMR10.01.0x105RMSRadiusvs.MolarMassGATE2_011.0x106MolarMass(g/mol)1.0x1071.0x108图9-4构型判断，rg对Mw作图。其U型曲线表明为典型的高支化度结构。3需要量多少个角度在低角度的时候，有杂质所产生的噪音信号干扰会很大，如图10所示，所以只取低角度，加上九十度两个角度，其误差就会相对很大；若只取九十度则只能求得分子量，无法测得旋转半径，所以最起码要加上一组高角度来修正，则误差会较少很多。图10杂质较多的GPC层析图Solvent图11三个检测角度9sca
13、tteringangleGlassCellOObservedangle4光散射仪器最基本的仪器miniDAWNTREOS如图11所示，在与入射光成45度、90度、135度角配置三组光电二极管检测器，同时检测不同角度的光散射强度，而激光经由样品槽的毛细管通道，样品槽为石英材质。如果要增加测量角度，可以如DAWNHELEOS在样品槽的两侧以不对称得方式增加检测器的数目，如图12所示可高达18个角度之多。五应用光散射强度与分子的大小及分子量有直接的关系，而SEC/GPC能分离不同尺寸及分子量的分子，结合此两种特性，可以得到许多有用的信息，并广泛地应用于高分子，生化及动力学等研究领域。图12十八角度检
14、测器1高分子聚合物特性利用多角度激光光散射系统合SEC/GPC不必依赖泵的流速,分子量及分子量分布等数据。(Multi-AngleLaserLightScattering_MALLS)结校正曲线及其它任何的假设，即可直接求得重均绝对MAT1:3DPlotIntensit图13光散射强度，洗脱体积与角度作图MALLS利用色谱柱分离出的样品在各个角度的光散射量（如图13）,由RI检测器得到的洗脱液浓度及dn/dc值，即可计算出各个切片的分子量。MALLS测得绝对分子量所需的各种物性均可由实验直接求得，无需作任何假设。而GPC的色谱柱又有分离杂质的功能，可以避免传统的光散射需极小心准备样品的麻烦。图
15、14显示高分子混合物经SEC分离后MALLS及RI的洗脱体积对照图。由此图看出RI对大分子量浓度低的物质较不敏感，而对低分子量高浓度者较敏感。SlnpUEhnrt-PEIRTA屋口3D(mL12.0!1-S.Q图14这是由ASTRA软件得到的miniDAWN（上）和Optilab示差检测器（下）信号。溶解酵素14,30014,6003001%亮氨酸脑啡肽55659263%1OM1口-IOwl口*1!-U.1UC.O吕.口1口“口volnunTOml_jt工-口图15分子量对洗脱体积图，有四个明显的峰Fw1ol=air弓vs-Volijimc1BSA67,00064,3007001%23缓激肽1,
