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1、6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用， 变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液 被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so2co2+3so2+4h2o+nh3 2nh3+h2so4（n h4）2so4 （2）（nh4）2so4+2nao2h2o+na2so4+2 nh3 反应（1）、（2）在凯氏瓶完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集 氨可用硼酸溶
2、液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25 即得。二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180C左右加热，放出一个分子氨 后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲 反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键， 或能过一个中间碳原子相连的 肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 而与蛋白质分子量及氨基酸成 分无关，故可用来测定蛋白质含量
3、。测定围为 1-10mg蛋白质。干扰这一测定的 物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质 少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精 确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1试剂：（1） 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白， 配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正 其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用h2o或0.9%nacl
4、配制，酪蛋白用 0. 05n naoh配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（cuso4?5h20和6.0克酒石酸钾钠（knac4h4o6?4h20，用500毫升水溶解，在搅拌下加入 300毫升10% naoh溶 液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期 保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到 1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。 充分摇匀后，在室温
5、（2025C）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。 用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白 质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、folin 酚试剂法（lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方 法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂， 即folin 酚试剂，以增加显色量，从而提高了检
6、测蛋白质的灵敏度。这两种显 色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合 物。folin 酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基 还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白 的量成正比。folin 酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生 物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得 多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式， 且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。
7、酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%）， 硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%）,丙酮（0.5%） 等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液， 只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色 浅，则必须提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度12倍。进行测定时，加folin 酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性 ph条件 下稳定，但上述还原反应只在 ph=10的情况下发生，故当folin 一酚试剂加到碱 性的铜一蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在
8、磷钼酸一磷钨酸试剂被破坏之 前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达 5mg。通常测定围是20250mg。（二）试剂与器材1试剂（1）试剂甲：（a） 10 克 na2co3, 2 克 naoh 和 0.25 克酒石酸钾钠 （knac4h4o6?4h2o。 溶解于500毫升蒸馏水中。（b）0.5克硫酸铜（cuso4?5h2。溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前， 将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。（2） 试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（na2wo4?2h20 ,25 克钼酸钠（na2moo4?2h20及700毫升蒸馏水，再加
9、50毫升85%磷酸，100毫 升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150 克硫酸 锂（Ii2so4）, 50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步 骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准naoh滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水 1倍，使最终的酸浓度为1n左右。（3） 标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白或 g球蛋白，溶于蒸 馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9%nacl溶 液。2. 器材（1）可见光分光光度计（2
10、）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其 余试管分成两组，分别加入0，0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8，1.0毫升标准蛋白质溶 液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂 甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（2025C）放置10分钟。再逐管加入 0.5毫升试剂乙（folin 酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则 会使显色程度减弱。然后在室温下放置 30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试 管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量
11、为横 座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时 间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入 5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已 超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加 入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试 剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画 好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右
12、，由上至下 的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的 吸光度值。folin 酚试剂法实验表管号45678910标准蛋白质00.10.2 0.4 0.6 0.8 1.0（250mg/ml）未知蛋白质0.2 0.4 0.6(约 250mg/ml)蒸馏水1.00.9 0.8 0.6 0.4 0.200.8 0.6 0.4试剂甲5.05.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（a700）2.样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白
13、质 20250微克），按上 述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。 通常样品的测定也可 与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增 加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量， 从而计算出 样品溶液的蛋白质浓度。注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随 不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度 （相对 于标准蛋白质）。四、改良的简易folin 酚试剂法（一）试剂1试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含 0.5n naoh 10%na2co3 0.1%酒石酸钾 和
14、0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后， 最后加入。2.试剂乙: 与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释 8倍。3. 标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55C恒温水浴中保温5分钟。 用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。改良的快速简易法，可获得与 folin 酚试剂法（即lowry基本法）相接近 的结果。五、考马斯亮兰法（bradford 法）（一）实验原理双缩脲法（biuret法）和folin 酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限 制，促使科学家们去寻
15、找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染 料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。bradford法的突出优点是：(1) 灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。(2) 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可 以在1小时保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完 全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。(3) 干扰
