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1、细菌基因组 DNA 提取方法1、取1.5mL菌液于2mL离心管，12000rpm离心5min，弃上清；2、加入600ul 1xTE重悬菌体沉淀，4C 12000rpm离心5min，弃上清；3、加入450ul 1xTE和50ul 10mg/mL溶菌酶和10ul 100mg/mL蜗牛酶，吹吸混匀，37C 孵育1h （或4C过夜），每隔15min颠倒混匀一次；4、加入600ul TENS裂解液，和与沉淀等体积的玻璃珠，吹吸混匀，涡旋震荡10min 后，再加入30ul 20mg/mL蛋白酶K,吹吸混匀，55C孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次；5、4C 12000rpm离心10min,转移上清至另一
2、个干净的1.5mL离心管；6、加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），充分混匀，-20C静置2min，4C 12000rpm 离心5min；7、转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），充 分混匀，-20C静置 2min，4C 12000rpm 离心 5min；8、转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，加入1/10体积的3M醋酸钠，2倍体积（加 入醋酸钠后的终体积）预冷的无水乙醇，充分混匀，-20C沉淀2h。（或加入0.6-0.8倍体 积的异丙醇，-20C沉淀2h）， 4C 12000rpm离心10min，弃上清；注：如需得到纯度更高的样品，可先用
3、异丙醇沉淀，无菌水充分溶解后，离心取上清， 再用醋酸钠+无水乙醇沉淀一次。9、加入600ul预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，颠倒混匀，4C 12000rpm离心5min，弃 上清；重复洗涤一次。10、吸干离心管中的残留液体，待离心管风干后，加入30ul无菌水和0.5ul10mg/mL的 RNase A,吹吸混匀，取3ul电泳检测，剩余置于-20C保存。附：一、所需仪器恒温水浴锅、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、超净工作台、通风橱、电子天平、称量纸、药 匙、各种规格移液器及吸头、剪刀、1.5mL离心管、2mL离心管、15mL离心管、50mL离心管、 涡旋震荡仪、掌上离心机、4C及-20C冰箱、微波炉
4、、电泳仪、凝胶成像仪、Nanodrop微 量分光光度计、烧杯、三角瓶、量筒、玻璃棒、封口膜、橡皮筋。二、所需试剂75%酒精、Tris、浓盐酸、EDTA、溶菌酶、蜗牛酶、蛋白酶K、NaCl、SDS （十二烷基磺酸钠）、 Tri ton XT00、NaAc （醋酸钠）、冰乙酸、无水乙醇、无菌水（或超纯水）、Tris饱和酚、 氯仿（三氯甲烷）、异戊醇、异丙醇、玻璃珠（直径1-2mm）、琼脂糖凝胶、RNaseA10XTE （pH 8.0）100 mM Tris-Cl，pH 8.010 mM EDTA，pH 8.0高压灭菌，室温保存，使用时超纯水稀释至1X浓度。1M Tris-HCl（pH 8.0）16
5、0 mL H），24.22g Tris碱，加入浓HCl 8.4 mL后冷却至室温，调pH 8.0,定容至200 mL。 高压灭菌，室温保存。0.5M EDTA(pH 8.0)160 mL HO, EDTA-Na-2H O (37.22g),磁力搅拌，用 NaOH (约 4g )调 pH 8. 0,定容至 200mL。 高压灭菌，室温保存。TENS裂解液终浓度Tris-Cl100 mM (pH&0)EDTA50 mMNaCl200 mMSDS2.0 %(w/v)Triton X-100 0.5%(v/v)母液浓度1M0.5M5M10%体积20mL20mL 8mL 40mL-J四种溶液混合后，再加
6、入ImLA Triton X-100,超纯水定容至200mLo高压灭菌，室温保存。蛋白酶K (20 mg/mL)工作浓度：l-2mg/mL用50 mM Tris-Cl (pH &0), 1.5 Mm Ca(Ac)2溶解蛋白酶K粉末，配制成20 mg/mL的贮存 液，过滤除菌，分装，-20C保存。2溶菌酶(10 mg/mL)工作浓度：lmg/mL用10 mM Tris-Cl (pH & 0)溶解溶菌酶粉末，配制成10 mg/mL的贮存液，过滤除菌，分 装，-20C保存。蜗牛酶(100 mg/mL)工作浓度：lmg/mL用10 mM Tris-Cl (pH & 0)溶解蜗牛酶，配制成100mg/mL的贮存液，过滤除菌，分装， -20C保存。RNase A(10 mg/mL)工作浓度：0.1mg/mL将 RNase A 溶解在 10 mM NaAc (pH 5.2)中，使终浓度为 10 mg/mL，100C加热 15 min， 室温下缓慢冷却，用0.1倍体积的1M Tris-Cl调整pH至7.4后，过滤除菌，分装，-20C 保存。TAE电泳母液(50X)Tris冰乙酸EDTA ddH?。定容至242g57.1 ml37.2g1L
