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1、宏基因组功能基因的筛选WCX2011年3月17日:宏基因组简介宏基因组的常用研究方法 16S （18S） rDNA测序宏基因组文库一功能基因筛选（策略一）宏基因组的测序一功能基因筛选（策略二）宏基因组(Metagenome )Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家Handelsman及其研究组于1998年提出，定义为the Genomes of the Total Microbiota Found inNature,即指耳特定环境样品中全部微生物遗传物质的总和，并且目前主要是指环境样品中细菌和真菌基因组的总和。dirGti i&olation of DNA from ttw on
2、virOnirb&nt| ojItivartiDn JgenomicsDNA frigem抽genomicsDNA knowledge applicationaMetagenomics in principle access 100% of the genetic resources of an environ merrt.Traditional cultivation methods and traditional genomics at best access 1%.:宏基因组简介 :宏基因组的常用研究方法 16S （18S） rDNA测序宏基因组文库一功能基因筛选（策略一）:宏基因组的测
3、序功能基因筛选（策略二）Metagenomics involves constructing DNA librariesfrom environmental DNAExtract metagenomicDNAConstruct 16S (18S) rRNA gene library using PCRsequenceEnvironmental sampleJ仝亠八Clone into vectoreg plasmid, COSmidphosmid, BACIntroduce intoMetagenomic libraryhost eg E. coliScreen for specie sequ
4、ences by PCR or hybridisationSIGEXFunctional screening for exuression ofparticular phenotype细菌16S rRNA的测序分析/16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA分子的对 应的DNA序列，也就是16S rRNA的编码基因。其长度大约为 1500 bp/通过16SrDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细 菌的分类和进化分析。 Haemophilufi paKagailinamm (M75O57) Haemophilus haemoglobinophtlus (M75064)
5、 Haemophilus parasuts (M 75065) Haemophilus somnus (M75046) Haemophilus ducreyi (M75079)43 Haemophilus pavacuniculus (M75061)569|Haemophiius pai9aphrohaemolyticus (M75076)Haemophiiifs parahaemolyficus (M75073)Isolate 6Haemophilus pa rain fl uenzae (M75081)1 Haemop h ilus para influenzae (M75082)*27L
6、 Isolate 4细菌16S rRNA的V3或V6区的测序分析Ashelford等(2005)通过对4383个细菌16S riDNA的序列进行比对分析，表明16S rDNA全长序列中包含9个可变区 （V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲 缘关系，可变区则表明物种间的差异。 Chakravorty等（2007）总结16S rDNA的序列，及其中 九个9个可变区和10个保守区的位置和长度，并指出不同的 可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3 （约60 bp）和V6 区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。1000Region V2Regions V4Regions V5
7、Region VI1j1RQ rDNA1 UO 1 Lzl MrARegion V6Regions V7|=:通过设计特异的PCR引物，扩增得到V3或V6区的序列，然 后两端加上接头，便可利用川umilla的高通量测序技术对V3或 V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物 种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。ITS(lnternal Transcribed Spacers ),即核糖体内转录间隔 区，是位于28S rDNA的3,端与18S rDNA的5,端之间的序列 AITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750 bpAITS包含ITS1和ITS2两个区域。
8、其中ITS1位于18SrDNA和 5.8S rDNA之间，ITS2位于 5.8S rDNA和 28S rDNA之间18S rDM5. 8S tVNA28S rDNAITS11TS239 1 1QS rDNA R ITS 区示倉3BITS 1和ITS 2是中度保守区域，其保守性基本上表现为种内相对一 致,种间差异比较明显。ITS的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，此外ITS序列片段较小、易于分析，目 前已被广泛应用于这种特点使ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。ITS I primerITS2 primer18S rDN
9、A云T8S rDNXrimerITSS primerrDNAi=i通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利 用川umilla的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌 等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。宏基因组文库环境样品宏基因组文库的构建抽提DNA克隆（多种载体）转化适宜宿主细菌（如大肠杆菌）宏基因组文库的分析宏基因组文库通过PCR或者杂 交筛选特定序列SIGEX通过功能筛选特定表型的阳性克隆基于宏基因组分离筛选功能基因的四个技术要素环境样品DNA制备高通量筛选High ThroughputScreening环境样品
10、DNA制备原位裂解法：将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯 化。in此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小，但由于强烈的 机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(150 kb),且腐殖酸类物质也 难以完全去除。异位裂解法：釆用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来,然后釆 用较温和的方法抽提DNA,如先釆用尼可登介质密度梯度离心分离微 生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNAo可获得大片段DNA (20500 kb)且纯度高，但操作繁琐，成本高，有 些微生物在分离过程中可能丢失,温和条件下一些细胞壁较厚的微生 物DNA难以抽提出来。载体A 般选用质粒、粘粒
11、或者Fosmid载体来构建文库，其插入片 断小于40kb,对生物合成比较复杂的化合物，因其基因簇较大 ,则无法完整克隆。细菌人工染色体（BAC）载体能克隆100 kb以上的大插入片断,完全有可能克隆到完整的代谢基因簇途径，但是其拷贝数目 和表达量低。因而可选择和改进已有的穿梭BAC载体来构建 文库,达到其拷贝数量可以诱导控制的目的，在必要时可诱导 增加载体拷贝数以获得大量DNA进行亚克隆和序列分析。宿主已报道的宏基因文库构建绝大多数釆用cosmid. BAC或fosmid为载体，其功能筛选宿主局限于大肠杆菌，但大肠杆菌并不是一个很理想的高效表达外源基因的宿主细菌, 因而构建广宿主或穿梭宏基因组
12、文库在充分挖掘和筛选功 能新基因的研究中尤为重要。序列驱动筛选基于DNA序列水平的筛选。根据某些已知的相关功能基因的保守序列或相似序列设计杂交探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆子。此方法的优点是可能筛选获得某一类结构或功能的蛋白质中的新分子，且能利用基因芯片技术大大提高筛选效率，缺点是必须对相关基因序列有一定的预先了解，较难发现全新的活性物质及其功能编码基因o功能驱动筛选生物活性水平的筛选，即根据重组克隆产生的新活性进行功能筛选。采用各种活性检测手段检测筛选分离阳性克隆子,结合生化分析和插入片段序列分析，进而对其进行深入研究。如可在各种选择性平板上通过可见性状筛选产生脂酶、淀
13、粉酶等活性克隆子。本策略能够直接发现全新的活性物质和功 能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大 ,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。SIGEXSIGEX (Substrate-induced gene-expression screening),即底物诱导基因筛选，其基本原理为：代谢相关基因通常由相应的化合物（如底物或者代谢）诱导表达。因此，通过建立特定的宏基因 组文库，利用流式细胞仪，筛选受一定底物诱导、 与载体中的特定标签（如GFP）共表达的克隆子， 就能够筛选到相应的代谢基因o利用特殊载体，建立宏基因组文库，通过流式细胞术，实现功能基因的高通量筛选Uchiyam
14、a et a/.,Nature,2009SIGEX筛选流程A 种操作子捕获(operon trap)载体A多拷贝，稳定性好A含有一个标记基因(如如)，能够与受底物诱导的操作子 基因片段共表达A标记基因前有自身可诱导启动子，能够检测自连的载体；A标记基因前有RBS位点和起始密码子，避免形成融合蛋白p18GFPAmpraC0IE1 on 气：Cloning site(BamHI)PSTOP STOP STOP RESSTART gfpGGATCC TAATTAATTAAGAAGG AGAFATACATATGGCTUchiyama et a/.,Nature,2009Step 1. Construc
15、tion of metagenomic libraries using p18GFP in liquid culture.Step 2. Removal of Self- ligated clones and the clones with constitutive expression of GFP.Step 3. Selection of the clones with expression of GFP in the presenee of the inducing substrate. Liquid culture + Inducing substrate (e.g. phenol) FACS:Selection of the clones
