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1、秦岭箭竹遗传多样性和克隆结构的SSR分析马青青刘建军(西北农林科技大学林学院，陕西杨凌712100)摘要：秦岭箭竹(Fargesia qinlinge)s是佛坪国家级自然保护区内海拔1800-2600m林下的主要植 被1。本文利用SSR分子标记技术对佛坪自然保护区秦岭箭竹的克隆多样性和克隆结构进行初步分 析。结果表明：1)7对SSR引物对秦岭箭竹2个居群共142个样本进行扩增分析，共得到79个位 点，其中多态性位点77个，多态位点百分率(PPB)为97.47%，Shannon多样性指数(I)为0.2263。 2)AMOVA分析表明，较大的遗传变异来自居群内(70.49%)，与基因分化系数(Gs
2、t=0.1418)的结 果相同，两居群间有了中等程度遗传分化。3)与其他克隆植物相比，秦岭箭竹克隆多样性水平较高。 基因型比率(PD)、Simpson指数和Fager均匀性指数(E)分别为0.7212、0.9127和0.5352，共得到 107种基因型且没有共同的基因型，每个基株平均有1.5426个分株，最大基株跨度约为5m。4)克 隆结构分析表明，秦岭箭竹的构型为密集型。关键词：秦岭箭竹；克隆多样性；克隆结构；SSR秦岭箭竹（Fargesia qinlinge）s属禾本科竹亚科箭竹属，仅分布于秦岭地区，耐寒性强，较耐干旱贫瘠土壤，在海拔2000m上下有大面积纯林，有的绵延数公里至数十公里2。
3、秦岭箭竹具有地 下茎合轴丛生的克隆生长方式3，是一种典型的克隆植物4。竹类长寿，开一次花和结一次籽，然 而在没有区分无性系分株间的遗传结构时，不能确定是否同时开花。已有研究表明竹子是以基株为 单位开花的，由于基株交错或镶嵌生长，每个基株的开花时间间隔不同，因而一片区域内开花时间 可以持续好几年5 6。生长于林下的竹子占野生大熊猫食物来源的99%7，秦岭箭竹是大熊猫夏 季食物的主要来源8，开花周期一般为50年9，其大面积开花或死亡会直接造成大熊猫食物短缺。 1970年岷山缺苞箭竹和糙花箭竹的开花事件就导致了 138只大熊猫的死亡10。因此，对秦岭箭竹 克隆多样性和克隆结构的研究对于高山地区的水土
4、保持和环境防护11和大熊猫的保护具重要的生 态意义。虽然能够通过挖掘来判断竹子的克隆结构，但其地下茎的延展和裂断使得竹子的遗传结构很难 被鉴别出来。为了准确了解竹类的遗传结构，分子标记法已经被广泛的运用于竹类克隆多样性和克 隆结构的研究中。目前对于秦岭箭竹的研究主要集中在分类与分布、生物量、种子萌芽、幼苗生长、 叶片光谱特性变化、无性系构件形态等方面，但是对其遗传多样性和克隆结构的研究还未见报导2 1213 14。本文利用SSR分子标记，初步探讨在巴山冷杉、红桦林下密集生长的秦岭箭竹的遗传 多样性、克隆多样性和克隆结构。1. 材料和方法1.1样地概况佛坪国家级自然保护区内海拔18002600m
5、为山地中温带，秦岭箭竹是该带林下的主要植被。该 带年平均气温26C，最冷月平均气温-2-9C，最热月平均气温1016C，年降水量8001000mm， 冬长夏短，低温而湿润15。本研究的采样地点位于佛坪国家级自然保护区的野猪荡，E1075040.4、 N3341，50.2，海拔约为2530m，此处秦岭箭竹密集地分布于巴山冷杉和牛皮桦林下。1.2实验材料为了确定初步的取样规模，我们于2013年8月进行预实验，样地命名为A。首先设立5mX5m 的格子以1mX1m为单位在交叉点上取样36个（气），然后横向扩增同样大小的格子，参照5点法取 样10个（a2），最后以5mX5m为单位向外扩大样地，并在交叉点
6、上取样，最终形成30mX 10m的矩 形样地A，共计取样61个（图1（A）。利用7对SSR引物对这61个样品进行克隆结构的分析， 发现最大的基株跨度为5m，有的每个个体就是一种基因型。为了进一步研究秦岭箭竹基株大小，2014 年8月我们在离样地A约120m处设置了 40mX40m的样地B （图1（B），每隔5m定距取样，共 得到样品81个。由于秦岭箭竹地下茎合轴丛生，我们依据McClure的取样方法，认为每丛代表一个 潜在的基株，每丛里的所有个体都是一个无性系分株16，即每一丛竹子基因型相同，采样时摘取每 一丛的一根竹子上的新鲜幼嫩叶片作为一个样品，最后将所有样品放入装有变色硅胶的塑封袋中干
7、燥保存。1.3研究方法1.3.1总DNA的提取和检测用植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取DNA，用ddH2O将其稀释 至50ng/pL，于-20C保存。具体操作按试剂盒提供的流程。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量， 用紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度。1.3.2引物筛选从http:/www.ncbi.nlm.nih.gov下载秦岭箭竹DNA序列来设计引物，共设计出51对引物序列， 由上海生工合成。为了获得扩增条带清晰、多态性好并且反应稳定的引物序列，随机选取2个样品 进行引物的首轮筛选，获得对引物，然后从剩下的样品中随机选取10个进行第二轮筛选。最后 共筛选出7
8、对多态性好且稳定的引物用于所有样品的扩增（表1）表1 7对SSR引物信息Table 1 Information of 7 polymorphic primers引物编号Primer重复基序Repeat motif5-3端引物序列5-3 Primer sequence退火温度Annealing temperature/C预期产物Expected production size/ bp035(GA)”GAGTCCTCCGCTCTGTGCAATAATTAATCACCCCATCTCCAAGC58155-193003(AG%TTACACCGCGAGCCGTCCATCAATGCACTGTCATGATCCG
9、CAAC59169-226008（TG）9AGAAAGATAGGGATAGTGATTGTGTTCCGAGGTGAAAAAGGAGGAACT57182-201012（AG）9GAGAGTGCCAAGAGACCACTGCTCACACACGCACACAACACAAA58135-180022(GA)11ACGTGTTAGCTCGGTTCGACTGTTCTCTTCCTCCCTACATCGTCT59168-226934（TA）6ACGGAACGGTACAATATATGCTTCTTGCCTTCTATGATGGTGTC55162-172306（*）11GCCGTCCAAACGCTCCTTCACCCATCCAT
10、CTTATGCTAT52257-2791.3.3 SSR-PCR反应体系PCR反应体系为20gL反应体系，包括2 x PCR缓冲液、50 ng模板DNA、0.16mmol/L dNTP、1.2mmol/L Mg2+、0.2gmol/L 引物和 1.0U Taq DNA聚合酶。1.3.4 PCR扩增体系PCR 反应在美国 Bio-RAD 公司生产的 MyCycler Thermal Cycler #170-9701EDU 型 PCR 仪上进 行。94C预变性5min, 55C左右退火(依引物不同而异)45s, 72C延伸45s，进行30个循环，72C延 伸5min后在4C保存。所有样品DNA交由
11、上海生工做毛细管电泳。1.3.5扩增产物检测用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，以100 bp DNA Ladder (康为世纪)作为对照对PCR扩增产物进 行检测。在DYY-6C型电泳仪(北京六一公司)上，稳任(5 Vcm -1),电泳2.5 h后银染检测扩增效 果。1.3.5数据分析毛细管电泳得到的结果为扩增产物的bp值，所有引物扩增bp值相同的样品为同一个基因型。 由于供试材料均为同源四倍体，利用SSR标记难以辨别杂合基因型，故本研究将SSR标记不进行基 因型判定，而是利用盖红梅SSR数据处理宏程序DataTrans 1.0将原始bp数据转化为0、1矩阵17。我们运用下列指数对克隆多样性进行分析
12、(Ellstrand &Roose1987) 181) 平均克隆大小(N/G)，即所有样本中基因型相同的为同一基株，G就是种群中基株总数，N就是 样本总数。不同基因型比率(G/N)2) Simpson多样性指数(D)，最初用来衡量物种的多样性和均匀度，现用于分析种群的克隆多样性。D = 1 Z N (N -1)/N(N -1)式中，Ni表示第i个基因型的基株数，N表示样本大小。D从0到1变化，D为0表示整个居群是 相同的基因型；D为1表示居群内每个样品的基因型各不相同。3) Fager指数(E) (Fager1972)，表示种群内不同基因型分布的均匀度。E = (D -Dmin)/( Dmax
13、 一 mQ其中，Dmin = (G -1)(2N - G)/N(N -1)，D= N(G -1)/G(N -1)式中，E从0到1变化，E为0表示整个种群只有一个基因型或有一个基因型占据主要优势而其他 基因型各包含一个样品；E为1表示种群内不同基因型有相同的样本。用POPGENE v1.32软件计算遗传多样性参数，包括多态位点百分率(PPB)、Neis基因多样 性指数(H)、Shannon多样性指数(I)、种群总遗传多样性(耳)、种群内遗传多样性(生)、 Neis群体遗传分化系数(Gst)、基因流(Nm)、Neis遗传多样性指数(H)、Neis遗传一致度和 遗传距离(D)。为了解种间亲缘关系，基
14、于Neis遗传距离。运用NTSYS-PC 2.1软件通过计算Nei 遗传相似性系数，对秦岭箭竹进行UPMGA非加权算术平均（Unweighted pair-group method analysis） 聚类并利用主坐标分析（PCOA）加以验证。用Arlequin ver 3.5.软件对种群内和种群间的遗传变异进 行AMOVA方差分析。2. 结果与分析2.1秦岭箭竹的SSR遗传多样性和遗传分化从设计的51对引物中筛选出7对对秦岭箭竹的142个样品进行PCR扩增，在物种水平上，7 对引物共检测到79个位点，多态性位点77个，多态位点百分率（PPB）、Neis遗传多样性指数（H）、 和Shannon
15、多样性指数（I）分别为97.47%、0.1323和0.2263,说明秦岭箭竹居群的遗传多样性较高。 在居群水平上，居群A和B的多态位点百分率（PPB）分别为46.84%和96.47%，Neis遗传多样性 指数（H）和Shannon信息多样性指数（I）分别0.0954和0.1282，0.1494和0.2299，说明居群B的 遗传多样性略高于居群A。表2秦岭箭竹居群的遗传多样性Table 2 Genetic diversity in two populations of Fargesia qinlingensis居群Population总位点Total number of loci多态性位点Number of polymorphic loci多态性位点百 分率Percentage of polymorphic loci(PPB)Neis遗传多样性指数Neis gene diversity(H)Shannons 多样性指数 Shannons information index(I)基因流Geneflow（Nm）基因分化系数Coefficient of ge
