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1、p16INK4a与妇科恶性肿瘤关系的研究进展【摘要】 p16INK4a基因是一种抑癌基因，在CyclinDCDK4/6pRbE2F通路中发挥重要负反馈调节作用，大部分恶性肿瘤中均发现该基因表达缺失。p16INK4a低表达是卵巢癌不利的预后指数，可作为卵巢癌独立的预后因子;p16INK4a在宫颈癌中呈过表达，有助于宫颈癌的筛查;p16INK4a在子宫内膜癌发生发展中起着重要作用，与子宫内膜癌转移灶发生率的增加密切相关;而在外阴癌HPV感染型中，常有p16INK4a过表达,是可靠的HPV阳性外阴癌的标记物。 【关键词】 pl6INK4a;卵巢癌;宫颈癌;子宫内膜癌; 外阴癌癌基因和抑癌基因对细胞周
2、期正、负反馈调节失控是细胞突变和恶性肿瘤发生的重要机制之一1。p16INK4a基因是人们发现的一种直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的抑癌基因，在CyclinD1CDK4/6pRbE2F通路中发挥重要负反馈调节作用2。由于该基因产物对细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4的活性具有抑制作用，因而也称为INK4 (inhibitor of CDK4)基因3。在大部分恶性肿瘤中均发现该基因表达缺失，但是在妇科肿瘤中p16INK4a基因的失活和表达却不尽相同,与妇科肿瘤的发生、发展及预后密切相关。因此，对p16INK4a表达的检测在妇科肿瘤的诊断和治疗中有着重要的临床意义。1 p16INK4a基因的结构、产物
3、及功能pl6INK4a基因位于染色体9p21，全长约8.5kb，由3个外显子和2个内含子组成，该基因位点又是少见的重迭编码基因位点，包含两个重迭基因INK4a和ARF,因阅读框不同分别编码蛋白Pl6INK4a和P14ARF，并分别对CyclinD1CDK4/6pRbE2F和MDM2P53通路起调节作用34。在细胞周期调控中，最重要的调节位于G1S期间，若此调控点失常，细胞异常增殖失控，可致肿瘤形成。pl6INK4a可与CDK4/6、CyclinD1CDK复合物结合，从而抑制Rb蛋白的磷酸化和转录调节因子E2F释放，诱导细胞G1S期停滞;p16INK4a基因的变异或其蛋白的失活会导致Cyclin
4、D1CDK4/6pRbE2F调节功能的失控，从而使细胞过度增殖，导致肿瘤发生5-6。近年来研究表明p16INK4a基因的失活广泛存在于多种肿瘤组织及其肿瘤细胞系中,其失活的机制主要有基因的缺失、突变和甲基化7。2 p16INK4a与妇科肿瘤2.1 卵巢癌卵巢癌的死亡率高居妇科恶性肿瘤首位8。尽管多数患者经过肿瘤细胞减灭手术及铂类、紫杉醇等联合化疗预后有所改善，但2a复发率仍超过70%。研究发现，p16INK4a低表达是卵巢癌不利的预后指数，在卵巢癌预后中有重要地位，与卵巢癌患者产生化疗耐药相关。Kommoss等8采用免疫组化试验对FIGO中300例bIV期卵巢癌患者进行p16INK4a蛋白表达
5、的检测发现，94%(283/300)患者p16INK4a呈阳性表达,6%(17/300)呈阴性表达,在低表达、中等表达和高表达的病例中,呈中等表达者存活率较高。Surowiak等9的研究也证实p16INK4a的蛋白低表达是卵巢癌不利的预后指数, 同时证实p16INK4a低表达与卵巢癌患者产生化疗耐药相关。在43例卵巢癌病例和6例正常卵巢组织中，取PL(primary laparotomy)和SCR(secondary cytoreduction)期共73例石蜡包埋样本，检测p16INK4a、Ki67和caspase3的表达，发现p16INK4a在正常卵巢上皮组织中定位于细胞核，而在卵巢癌组织中
6、定位于胞质和胞核，统计分析证明p16INK4a低表达主要是在年轻病例和死亡病例中。KaplanMeiers生存曲线分析p16INK4a低表达表明患者总生存率缩短,证实p16INK4a低表达是卵巢癌不利的预后指数。2.2 宫颈癌宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤中其发病率仅次于乳腺癌10，p16INK4a在宫颈癌的发生发展中起着重要作用。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌的主要病因，几乎100%高危型人乳头瘤病毒(high riskHPV，HRHPV)阳性的宫颈癌和癌前病变中pl6INK4a呈阳性表达1112。p16 INK4a较HRH
7、PV更具有敏感性和特异性，可以评估各种HPV亚型的致癌性。Eleuterio等13应用免疫组化方法检测l3例重度鳞状上皮内病变、26例轻度鳞状上皮内病变和57例宫颈正常组织中Pl6INK4a蛋白表达，表达率分别为92.3%、l5.4%和0%;重度鳞状上皮内病变中，pl6INK4a表达的诊断敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别是92.3%、100.0%、100.0%和98.3%。pl6INK4a与重度鳞状上皮内病变的相关系数为0.95，HRHPV与高危上皮内瘤变的相关系数为0.47,HRHPV感染阳性的标本P16INK4a蛋白表达均为阳性，证实P16INK4a蛋白表达的检测用于宫颈上皮内瘤
8、变辅助诊断比HRHPV更具有敏感性。Ishikawa等14通过检测p16INK4a和HPV表达率来评估各种HPV亚型的致癌性，在CIN I、和宫颈鳞癌中HRHPV感染率分别为69.8%(37/53)、97.5%(39/40)、91.7%(44/48)和100.0%(16/16);HRHPV阳性的CIN I、和SCC(squamous carcinoma of cervix)中p16INK4a阳性表达率分别是32.4%(12/37)、82.1%(32/39)、93.2%(41/44)和100.0%(16/16)。在CIN I、中p16INK4a表达是明显有区别的，HPV导致的细胞周期失调多发生在
9、CIN中，在CIN I中p16INK4a过表达发生在HPV16、HPV52多于HPV51、HPV35。用p16INK4a表达做为HPV致癌性的分子标记，证实各种亚型高危HPV导致pRb功能障碍的水平是不同的，在CIN中发生率最高。目前，尚没有单一可靠的宫颈癌筛查方法。Pl6INK4a蛋白表达在宫颈癌筛查中虽不能替代高危HPV检测，但可以作为协助高危宫颈上皮内瘤变的组织学诊断指标,宫颈癌进展中高危HPV病毒的整合是必需的，HPV病毒整合和游离状态下pl6INK4a表达并不是都呈阳性。Samama等15做了这方面的研究，对241例宫颈液基细胞学涂片，行巴氏染色分级，同时分别用原位杂交技术和免疫组化
10、技术检测HRHPV和pl6INK4a，观察到所有重度鳞状上皮内病变整合的HRHPV均呈阳性，pl6INK4a过表达。但是在部分阴性HPV和ASCUS中pl6INK4a表达呈阳性，而有些pl6INK4a表达阴性的ASCUS和轻度鳞状上皮内病变中则包含游离型HRHPV。提示如果用pl6INK4a检测替代HRHPV检测，有些HRHPV阳性但是pl6INK4a表达却呈阴性，这部分病例有可能癌变，但是却不能得到筛查。所以联合pl6INK4a和HRHPV检测比较适合于宫颈涂片的筛查。Redman等16的研究也认为pl6INK4a表达可以协助高危宫颈上皮内瘤变的组织学诊断,增进癌前筛查,减少不必要的手术操作
11、。2.3 子宫内膜癌子宫内膜癌是常见的、发病率逐渐上升的女性生殖系统恶性肿瘤，与宫颈癌和卵巢癌并列为妇科三大肿瘤。其发生是一个复杂的多阶段生物学过程，受细胞内多个肿瘤相关基因的调控。pl6INK4a基因在子宫内膜癌发生发展中起着重要作用。Adamovic等17以动物模型进行子宫内膜癌的遗传分析，证实CDKN2A(Cyclin dependent kinase inhibitor 2A)基因位点异常是导致子宫内膜癌的主要遗传事件。CDKN2A基因位点编码P14ARF和P16INK4a两种蛋白,故P16INK4a蛋白可能在子宫内膜癌发生发展中起着重要作用。在子宫内膜癌中pl6INK4a基因的改变尤
12、其是缺失和子宫内膜癌转移灶发生率的增加密切相关。Ignatov等18对46例子宫内膜癌患者用免疫组化方法检测Pl6INK4a蛋白表达，MSPPCR方法检测pl6INK4a启动子区甲基化状态，PCR分析pl6INK4a基因缺失状况。pl6INK4a异常表达为无或极轻微(染色分级<15%)的占39.2%(18/46)，这和pl6INK4a基因失活高度相关(P<0.01)。pl6INK4a基因失活因素检测，缺失率为56.5% (26/46),启动子甲基化率为17.4%(8/46)。pl6INK4a总基因失活率，早期()为60.0% (21/35)，晚期为()100.0%，晚期明显上升，差
13、异具有统计学意义(P=0.02)。原发性子宫内膜癌中伴有转移灶的病例有93.3% (14/15)pl6INK4a失活，没有转移灶的病例pl6INK4a失活率为58.1%(18/31)，子宫内膜癌转移灶发生率和pl6INK4a基因失活有显著正相关性(P=0.018)，pl6INK4a表达缺失可能和子宫内膜癌侵袭性有关。肿瘤微转移是影响患者预后的独立指标之一，判断子宫内膜癌转移灶的发生率对病例的分级、降低复发率、改善患者预后、提高患者生存率等方面有潜在的临床应用价值。2.4 外阴癌外阴鳞状上皮癌(vulvar squamous cell carcinomas，VSCCs)简称外阴癌，是起源于皮肤或
14、粘膜棘细胞的恶性肿瘤,占女性生殖道恶性肿瘤的3%5%。外阴癌发生有两条途径，即HPV依赖型和非HPV依赖型。Avoort等19对73例外阴瘤变标本中HPV与p14ARF和p16INK4a的关系进行检测，发现p14ARF和p16INK4a同时表达与高危HPV感染有高度相关性。HPV、p14ARF和p16INK4a随着外阴上皮内瘤变(vulvar intraepithelial neoplasia，VIN)病变程度地增加其阳性表达率也逐渐增加。在分化型VIN 中仅发现1例高危HPV阳性,p14ARF表达率为0%，p16INK4a阳性表达仅发现两例。在20例外阴非瘤变病例中高危HPV与p14ARF和
15、p16INK4a表达无相关性，进一步证实外阴鳞状细胞癌是通过两条不同途径发展而来的多因子疾病，其一是HPV依赖型途径，类似于CIN和宫颈癌，另一是HPV非依赖型途径。近年来研究表明，女性外阴癌中HPV感染型常有p16INK4a过表达，检测P16INK4a蛋白表达可以改进其组织学分类。Santos等20对92例VSCCs P16INK4a和P53蛋白的表达及HPV进行检测，16例HPV阳性(17.4%)的VSCCs中, P16INK4a和P53的阳性率分别为100.0%和6.2%，而其它HPV阴性的肿瘤中，P16INK4a和P53的阳性率分别为2.3%和64.5%。就评价HPV阳性而言，p16INK4a的灵敏性和特异性分别为100%和98.7%;按组织学标准判断，灵敏性和特异性分别为93.8%和35.5%;用P53染色标准判断，灵敏性和特异性分别为62.5%和93.4%。由此可见，用p16INK4a染色检测HPV感染的效率远远高于组织学标准和P53染色。HPV阳性的VIN 期中53.8%为基底细胞样型和疣状型,包括3例角化型，所有这些肿瘤中p16INK4a均为阳性反应，而P53为阴性;HPV阴性的VIN 期中45.6%为分化型，其中P53阳性率为90.8%，p16INK4a均呈阴性表达。由此可见p16INK4a是可靠的HPV阳性标记物; p16INK4a免疫组化染色可以改进
