《土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸》由会员分享，可在线阅读，更多相关《土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、-土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法熏蒸提取-仪器分析法1.1 根本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后24h，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数KEC，从而计算土壤微生物生物量碳。1.2 实验仪器自动总有机碳TOC分析仪Shimadzu Model TOC500,JANPAN、真空枯燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。1.3 实验试剂1无乙醇氯仿CHCL3；20.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4
2、溶于1L蒸馏水中3工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理过筛和水分调节略1.4.2 熏蒸称取新鲜相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空枯燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿约2/3的15ml烧杯2或3只，烧杯放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，枯燥器底部参加少量水以保持容器湿度。盖上真空枯燥器
3、盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空枯燥器阀门，于25黑暗条件下培养24小时。1.4.2 抽真空处理 熏蒸完毕后，翻开真空枯燥器阀门应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做，取出盛有氯仿可重复利用和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁枯燥器，反复抽真空5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全翻开枯燥器盖子，直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一枯燥器中为不熏蒸对照处理。注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提1.4.4 浸提过滤从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，参加40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液土水比为1:4，考虑到土样的原因
4、，此局部熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个参加量要根据TOC仪器的进入量决定300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或20冷冻保存但使用前需解冻摇匀注意这局部很重要，有研究结果说明：提取液如果不立即分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元。1.4.5 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进
5、展稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。注入自动总有机碳TOC分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪Shimadzu Model TOC-500,JAPAN为例。1.5 计算SMBC=(ECCHCL3ECCK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/0.452 土壤微生物生物量氮茚三酮比色法土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%7%，是土壤中有机无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下2.1 根本原理茚三酮比
6、色法 Amato和Ladd1988研究说明新鲜土样熏蒸过程所释放出的氮，主要成分为-氨基酸态氮和铵态氮，这两种氮形态可以用茚三酮反响定量测定，并发现熏蒸与未熏蒸土壤提取的茚三酮反响态氮的增量，与其土壤微生物生物量碳之间存在显著的相关性。因此，人们采用熏蒸提取茚三酮比色法来测定土壤微生物生物量氮FE-Nnin。2.2 实验仪器 分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空枯燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等2.3 实验试剂1无乙醇氯仿CH3Cl；20.5mol/L (K2SO4)溶液：称取硫酸钾K2SO487g，溶于去离子水中，稀释至1000ml；3pH5.2的乙酸锂LiOHH2O溶液：称取
7、氢氧化锂LiOHH2O168g，加入冰乙酸优级纯279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%氢氧化钠溶 液调节pH至5.2。4茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜C2H6OS和乙酸锂溶液50ml参加4g水合茚三酮C9H4O3H2O和0.12g复原茚三酮C18H10O62H2O搅拌至完全 溶解；550%乙醇水溶液：吸取50ml 99%乙醇于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容；61mol/L的硫酸铵(NH4)2SO4标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵称 前105烘2h溶于0.5mol/L 硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000ml，摇匀，于4冰箱中保存。70.1mol/L 的硫酸铵
8、(NH4)2SO4标准液：吸取10ml 1mol/L的硫酸铵标准 储存液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100ml，摇匀。此 溶液最好现配现用。8工作曲线的制备：分别吸取0.00ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、mol/L的硫酸铵标准液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液 定容至100ml，摇匀，其浓度分别为0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、 1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L硫酸铵标准氮的系列溶液。2.4 操作步骤2.4.1 土壤的前处理和1.4.1一样2.4
9、.2 熏蒸和1.4.2一样2.4.3抽真空处理和1.4.3一样2.4.4 浸提过滤从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，参加40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液土水比为1:4，考虑到土样的原因，此局部熏蒸和不熏蒸土均为2g，即，2g土：8ml的硫酸钾溶液300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或20冷冻保存但使用前需解冻摇匀注意这局部很重要，有研究结果说明：提取液如果不立即分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一
10、次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元。2.4.5 分光光度计比色测定此处沸水浴不好控制吸取0.5ml样品提取液和标准工作液，分别置于10ml的塑料离心管中，参加2ml茚三酮显色剂，涡旋搅拌充分混匀，置于试管架上，在沸水中水浴15min，迅速冷却冰浴约2min，参加5ml稀释液50%乙醇水溶液，摇匀于570nm下比色。2.5 结果计算SMBN=(ECCHCL3ECCK)*稀释倍数*原来的水土比*5v 土壤微生物生物量氮的测定全氮测定法,建议使用此法注意：所配的试剂和全自动凯氏定氮仪的试剂一样，具体见农化分析课本2.4.1 土壤的前处理和1.4.1一样2.4.2 熏蒸和1.4.2一样
11、2.4.3抽真空处理和1.4.3一样2.4.4 浸提过滤从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，参加40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液土水比为1:4，考虑到土样的原因，此局部熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，2g土：16ml的硫酸钾溶液300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或20冷冻保存但使用前需解冻摇匀注意这局部很重要，有研究结果说明：提取液如果不立即分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0
12、.2um的滤头，一个才1元。2.4.5 全自动凯氏定氮仪的测定吸取10ml滤液与消煮管中，参加K2SO4CuSO4Se混合催化剂1.08g，参加4ml浓硫酸；同时设置23空白10ml的0.5mol/l的K2SO4，参加K2SO4CuSO4Se混合催化剂1.08g，参加4ml浓硫酸；在高温消化340消煮3个小时至澄清后放置2-3h。然后用全自动凯氏定氮仪测定浸提液中的全氮含量。2.5 结果计算 EN=(VS-VO)*CH2SO4*14*1000*(16/10)WS式中：EN为全氮，VO为滴定空白对照所消耗的标准硫酸体积注意：消煮一批土样至少需要3个对照，VS为滴定土样所消耗的标准硫酸体积，CH2
13、SO4为硫酸浓度这个浓度要进展标定的，具体见农化分析课本，14为氮的摩尔质量，1000为千克转化成克，16/10为从16ml的提取液中吸取10ml，WS为干土重所以： 土壤微生物生物量氮Bn=(ENCHCL3ENCK)/0,54见?土壤微生物研究原理与方法?，主编：林先贵 中科院土壤研究所3 土壤微生物生物量磷无机磷测定法Brookes等1982报道土壤熏蒸处理所释放出来的磷大局部为无机磷酸盐，可被0.5mol/LNaHCO3等提取剂提取，而且熏蒸和未熏蒸土壤之间无机磷的差异，能够反映土壤微生物生物量磷的上下。于是，Brookes等建立了土壤微生物生物量磷的熏蒸提取-无机磷测定法。3.1 根本
14、原理新鲜土壤经氯仿熏蒸后24h，采用0.5mol/LNaHCO3溶液提取被杀死的土壤微生物生物量磷，在锑钼抗混合试剂作用下提取液中正磷酸与钼酸络合形成磷钼杂多酸在一定酸度条件下，可用磷钼比色法测定提取液最好全磷含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机磷量的差值和转换系数kp，这个系数很重要，因为如果没有这个系数，所测定的结果就是土壤的速效磷，但是土壤微生物熏蒸后释放的磷大多数是无机磷，而速效磷包括全部水溶性磷、局部吸附态磷及有机态磷，有的土壤中还包括*些沉淀态磷，因此速效磷和无机磷的畴不一样，不要搞混 以及外加无机磷的回收率Rpi作为校正系数，从而估算土壤微生物生物量磷。3.2 实验设备分光光度
15、计、硬质试管、水浴锅、真空枯燥器、离心机、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等3.3 实验试剂1无乙醇氯仿CH3Cl；20.5mol/L碳酸氢钠NaHCO3浸提液：溶解NaHCO342.0g于800ml水中，以0.5mol/LNaOH溶液调节浸提液的pH至8.5，再用蒸馏水稀释至1000ml。此溶液曝于空气中可因失去CO2而使pH增高，可于液面加一层矿物油保存。此溶液储存于塑料瓶中比在玻璃瓶中容易保存，假设储存超过一个月，应检查 pH是否改变；3磷酸二氢钾溶液【pKH2PO4=250 ug p /ml】：称取1.0984g分析纯磷酸二 氢钾称量前105烘23h，溶于去离子水并定容至1000ml；4钼锑抗试剂：间鲍士旦的土壤农化分析课本5磷标准液：准确称取在105烘箱中烘干的KH2PO4分析纯0.21
