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1、小麦萌发前后淀粉酶活力的比较及电泳法测定蛋白含量l=JI三三一. 实验目的1. 掌握利用光照培养箱培养小麦的方法；2. 了解酶的制备及活力测定的一般原理与方法；3. 掌握淀粉酶的活力测定技术，了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化；4. 巩固对721或722S型分光光度计和离心机的熟练使用；5. 灵活运用3, 5-二硝基水杨酸比色法测定样品中还原糖含量的原理和方法；6. 掌握SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳法；二. 实验原理种子中的碳水化合物主要是以淀粉的形式存在。淀粉酶是一种水解酶，它能使淀粉水解 为麦芽糖，催化反应为：(IvH“Um) +nIijUnisIisUi6 10 5212 22 11麦芽
2、糖具有还原性，与3, 5-二硝基水杨酸在供热的条件下生成棕色的3-氨基-5-硝基 水杨酸。在一定范围内，棕色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比，因此可利用比色法 测定还原糖的量。休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌发后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而 增加。三. 实验步骤1. 种子发芽小麦种子浸泡2.5h后，放入25C恒温箱内发芽。2. 酶液提取取发芽第三天或者第四天的幼苗8株，放入研钵中，加入石英砂少许，加入PH6.8磷酸盐缓 冲液10ml，研磨至匀浆状。在室温下静置20min，搅拌几次。提取液1500rpm离心7min。 上清倒入量筒，测定酶提取液总体积，并将酶液稀释10倍。取干
3、燥种子或者浸泡2.5h后的种子8粒作为对照，步骤同上。3.SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳法测定蛋白条带。4.酶活力的测定(1)取大试管6支，按照下表加入各试剂(1)取大试管6支，按照下表加入各试剂空白标准明发刖明发后123456酶液（ml）0.50.50.50.50.1%麦芽糖（ml）0.51%淀粉（ml）111111水（ml）0.5将各试管摇匀，放入37水浴锅中保温3min，立即向各试管中加入DNS试剂2ml。（2）取出各管，放入沸水浴中加热5min，流水冷却至室温，加水稀释至25mL，充分混匀后 1:1稀释。用空白管做对照，在520nm处测定各管OD值，并对3和4、5和6管分别取平均 值作
4、为萌发前和萌发后的OD值。四.计算根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即A标准/A未知=C标准/C未知可推导出C酶液*酶液/A标准XC标准8粒的总活力=C酶xn酶xV酶A为光吸收值；C酶=酶液管的麦芽糖浓度;n酶=酶液稀释倍数;V酶=提取酶液总体积。五.蛋白质浓度测定一考马斯亮蓝G250染色法蛋白质定量测定溶液0管酶液（明发刖）酶液（明发后）蛋白液/mL一一0.10.10.9%生理盐水/mL1.00.90.9蛋白质染色液/mL5.05.05.0轻轻摇匀，5min后以0管调空白，595nm分光光度法测光密度值。六、实验结果（1）酶活力的测定明发前明发后酶提取液总体积9ml8ml酶液最终稀释后测
5、定的小麦萌发前与萌发后的OD值空白标准明发前明发后123456OD值0.2480.2170.1850.6120.669平均值0.2480.2010.641n 酶=10x (25/0.5) x2=1000 A 标准=0.248，C 标准=0.001%，L萌发前酶液如201，V酶=9.0mlC 酶液=A 酶液/A 标准xC 标准=0.201/0.248x0.001%8粒的总活力=C酶xn酶xV酶=0.07292、明发后：A 酶液=0.641，V 酶,=8.0mLC 酶液=A 酶液/A 标准xC 标准=0.641/0.248x0.001%8粒的总活力=C酶xn酶xV酶=0.207(2)蛋白质浓度的测
6、定明发前明发后1234OD值0.1040.1210.0640.128平均值0.1130.096小麦明发刖：A蛋白质=0.113由标准曲线，Y=0.0081X 0.0515, R2=0.9842可知，x为20.3086，由于酶液被稀释了 10 倍，所以，蛋白质浓度为203.086/ ml。小麦明发后：A蛋白质=0.096由标准曲线，Y=0.0081X 0.0515，R2=0.9842可知，x为18.2099，由于酶液被稀释了 10 倍，所以，蛋白质浓度为182.099/ ml。七、讨论由实验数据结果可以看出小麦萌芽后淀粉酶的活力会比萌芽前明显增强，小麦种子在 明发过程中淀粉酶活力升高，淀粉被大量水解为小分子糖，那么就可以提供较多的能量供应 萌发时候的细胞分裂以及细胞生长使用，同时还能够为细胞的生命活动提供原料，能够更快 地将储存的有机物中的能量释放出来，保证明发过程能量供应充足。八、实验注意事项1、种子研磨应均匀，以助于酶液的提取。2、在测定蛋白质浓度及酶液时，应快速测量，以防止反应试剂的分解，提高测定的正确性。3、实验过程中注意安全。
