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1、摘要从烟台葡萄果皮以及干红葡萄酒酿造过程不同阶段发酵液中取样分离得到117株酵母菌株，将分离菌株用WL培养基进行鉴别培养，依据菌落色泽初步归 类，然后利用 26S rDNA D1/D2 区域序列分析，并结合其形态学和生理生化特性 对 21 菌株进行分类鉴定,确定了发酵过程中酵母种类及其菌群变化特点。用杜氏管发酵试验对117株酵母菌株筛选，挑选其中21株发酵力、香味较 好的酵母菌株完成抗性和发酵特性评价。有 5 株发酵力强的菌株进行了模拟酒精 发酵试验，结果SL8-1发酵产酒精度最高为10.8 , SL9-1发酵产酒精度为10.2 高于RC212的产酒度9.2，SS9-2产酒精度与商品酵母RC2
2、12相同，SS5-1的 产酒精度为7.4，SS1-5酵母菌株发酵产酒精度为0，但香气浓郁。对筛选的5株优良菌株进行26SrDNA D1/D2区分子鉴定，并与模式菌株序 列比对分析确认 5 株酵母 SL8-1,SL9-1,SS9-2,SS1-5,SS5-1 均为酿酒酵母，此 后以商品酵母为对照进行同步RAPD扩增，比较遗传多样性，结果显示这5株 酿酒酵母菌株与发酵时接入的商品种子酵母之间多态条带无明显差异。但两个菌 株(SL8-1,SL9-1 )的发酵特性，尤其产酒率显著高于商品酵母。关键词:干红葡萄酒 酵母 发酵特性 评价 鉴定ABSTRACT117 natural yeast strains
3、 were isolated from Yantai grape fermentation solution of different phase In this paper. Then the strains were classified according to colorful reaction characteristics that showed on the WL medium, and were identified based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequence analysis and physiological morphologi
4、c characterization, in order to study the changes of the yeasts during the period of fermenting.21 strains with high fermentation capacity and strong aroma were selected out from 117 strains by Durham tube method. Among them ,5 excellent strains have good fermentation capacity and nice smell. The re
5、sult of alcohol fermentation showed that alcoholicity of SL8-1 yeast strains was10.8, alcoholicity of SL9-1 yeast strains was10.2, SS9-2 has same alcoholicity with RC212, alcoholicity of SS5-1 yeast strains was7.4, alcoholicity of SS1-5yeast strains was zero ,but it had thick aroma.DNA from the exce
6、llent yeast strains then were extracted by micro glass beads and amplified by PCR method. Compare the result sequence with the model strain so as to classify the yeast strains, the result showed that all the 5 strains are saccharomyces. DNA from the excellent yeast strains were analyzed by RAPD-PCR
7、method in order to determine their homology with commercial yeast RC212. We have got that the 5 strains have no difference with the commercial yeast RC212,but the alcoholicity of SL8-1,SL9-1 is better than the commercial yeast.Key Words: Red wine;Yeasts; Fermentative characteristic; Assessment; Iden
8、tification第一章 前言1.1.干红葡萄酒简介 葡萄酒是由以整粒或压碎的新鲜葡萄浆果或葡萄汁经酵母发酵而成的低 度饮料酒，其成分构成极其复杂，酒中主要成分源自葡萄果粒，如糖分、酒石 酸、苹果酸、花色素、单宁、矿物质等，也有部分组分来自发酵过程和陈酿期 间，如乙醇、甘油、酯类等。葡萄酒不仅具有人体生长发育所需要的营养物质， 而且还含有一些调节人体生理机能的微量物质。葡萄酒中的白藜芦醇可阻止血 小板凝聚，预防血栓病，抑制蛋白质-酪氨酸激酶的活性，有防癌抗癌作用。 另外，葡萄酒可以预防肾结石，助消化等1。在实际生产中，葡萄酒酿造从来 不是纯粹发酵，这不仅是因为从开头到底没有完全由一种酵母发酵
9、，而且往往 会发现乳酸菌发酵葡萄醪液中的苹果酸，这种发酵是常常受到欢迎的。31.1.1 干红葡萄酒的工艺流程红葡萄f分选!破碎!去梗3添桶白兰地原料蒸馏1.2 酵母菌特性酵母菌是重要的工业微生物与科学研究的模式生物，在食品、医药、能源化工、 科学研究和环境治理等领域有重要应用价值。野生酵母资源的开发利用是发酵工 业菌种改良的基石，也是基因多样性的重要来源2 。酵母菌的增殖力即能在短时间内繁殖出大量活细胞的酵母菌，才能称为优质 酵母菌。影响酵母菌繁殖速度的因素，首先是营养物质、氧气，其次是温度（温 度对酵母菌能量和基础物质代谢产生影响），另外是接种酵母菌的活力（取决于有 关酵母菌的营养状态和生长
10、时间，应在对数生长期内进行转接）。 6酵母菌的耐酸、耐酒精能力：每种酵母菌的抗酸、抗酒精和耐高温的能力是 有差异的。酸度和酒精度对酵母菌的生长和发酵有阻碍作用，高温导致酶系统的 钝化以至失活。当酒精度10% （vol）时酵母菌生长被抑制。高浓度发酵时，渗透 压高，易引起酵母菌新陈代谢紊乱，酵母菌活力下降。6 1.2.1酵母菌对干红葡萄酒发酵过程的影响葡萄汁的发酵是多个酵母菌种及菌株互作生长和发展变化的复杂体系。葡萄 酒发酵过程是一个复杂的生态和生化过程，包含不同酵母属种此消彼长的变化。 多种酵母在发酵过程中的相互协作，可以有效地增加葡萄酒风味的多样性7，但 也可能影响葡萄酒质量的稳定性8 这些
11、酵母菌的来源有：葡萄浆果表面的土著菌 群，酿酒设备和酒厂环境中的土著菌群，接种的人工酵母等， 5本文主要研究从 葡萄汁发酵液中分离到的酵母菌株，葡萄酒酵母菌在干红葡萄酒的发酵过程中起 到很重要的作用，葡萄酒酵母在果汁中产生葡萄香或葡萄酒香，酵母对葡萄酒的 香味起到极其重要的作用。8不同种的酵母菌所能发酵糖的种类不同，因此，需视原料品种所提供发酵糖 的类型来选择适当的酵母菌。作为酿酒酵母菌，能够发酵霉菌淀粉酶的分解产物 （如葡萄糖和麦芽糖等），也可使半乳糖、蔗糖及13的棉子糖发酵，但不发酵乳 糖。多数酵母菌有蔗糖酶，可使蔗糖发酵，但发酵强弱有所不同。12酵母菌的 发酵力指酵母菌发酵糖产生酒精能力
12、的大小。只有酒精转化率高，残糖率小，才 能称为发酵力强的酵母菌。91.2.2酵母菌的研究现状近年来，国内外对葡萄酒酵母菌的研究热点主要集中在特色天然葡萄酒酵母 菌的分离和筛选以及葡萄酒酵母菌的多样性与葡萄酒特殊风味间关系的研究。酵 母菌在自然界中广泛存在， 我们可以从不同的生物环境中分离得到，根据不同 的地区、不同的环境可筛选出具有地域特色或者品种特色的优良酵母菌株。即选 用从地产葡萄上分离、筛选出的优良天然酵母进行发酵，必须经过多种菌株的发 酵比较，根据其发酵能力和发酵结果筛选出适合某种葡萄酒生产的天然优质酵 母，用于产生色香味俱全的优质名酒。除此之外，酿酒酵母菌对作为地区特色品 种的葡萄的
13、特色风味和总体风味的影响方面的研究，逐渐显露出较大的发展趋 势。5在酵母的资源利用方面，法国、美国和意大利葡萄酒发达国家走在世界前列， 适用于不同产地、葡萄酒类型和葡萄品种的“特种”酵母已经逐渐取代了“广适 性”酵母。目前我国在葡萄酒酵母的研究和利用方面还处于起步阶段，葡萄酒生 产所用菌种大部分依赖进口，单一菌种接种的纯种发酵使得葡萄酒失去了其特征 的香气和风味。但从酿造学的观点来看，用本土的土著菌种接种发酵或者与其他 接种物相混合进行发酵，可以生产出具有地区特色的葡萄酒另外，当地优选的菌 种由于适宜当地的风土环境，因而具有更强的发酵竞争力。121.3 目的意义来自葡萄果皮的天然酵母在葡萄酒生
14、产过程中对商品酒的质量和风味有重 要影响。通过分离、鉴定和发酵特性的评价，了解商品酵母与天然酵母在酒精发 酵过程中的变化规律，探究天然酵母菌株对干红葡萄酒色、香、味及营养成分的 影响，以及与商品酵母菌株之间的协同效应，通过发酵试验筛选出发酵特性以及 香味比较好的菌株进行酒精发酵试验。1.4 研究内容和技术路线分离和纯化酵母菌株细胞形态鉴定1F菌落形彳态观察菌种分子鉴定酵母菌株抗性评价*优良菌株发酵特性评价第二章 材料和方法2.1.材料2.1.1 菌株分离自烟台葡萄果皮及干红葡萄酒发酵过程中不用时期的发酵液，共分离得 到酵母菌株 117 株。2.1.2 主要培养基YEPD固体培养基：葡萄糖2%，
15、蛋白胨1%，酵母浸粉1%,琼脂2%WL固体培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%,琼脂2%,磷酸二 氢钾0.055%，氯化钾0.0425%，氯化钙0.0125%，氯化铁0.00025%，硫酸镁0.0125%， 硫酸锰0.00025%,溴甲酚绿0.0022%, pH值为6.5。抗性及发酵特性评价培养基耐高糖液体培养基：酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，不同浓度的葡萄糖(400.0g/L、500.0g/L、600.0g/L )蒸馏水 1L, 115C灭菌 30min。耐SO2培养基：葡萄糖20g,酵母浸粉10g,蛋白胨10g，蒸馏水1L, 121C灭菌20min 后添加 H2SO3，SO2 终浓度至 200、300、400、500、600mg/L。耐高温培养基：葡萄糖20g，酵母浸粉10g,蛋白胨10g,蒸馏水1L, 121C灭菌 20min 后处理温度分别为 35C、 40C、 45C、 50C、 55C。耐酒精培养基：葡萄糖20g，酵母浸粉10g,蛋白胨10g,蒸馏水1L, 121C灭菌20min 后,添加无水乙醇,终浓度至 60、 80、 120、 140、 160mL/L。耐高渗培养基：葡萄糖20g,酵母浸粉10g,蛋白胨10g，蒸馏水1L,添加固体NaCl 使其终浓度至 60.0g/L、 80.0g/L, 100.0g/L, 120.0g/L,
