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1、第2节 微生物的培养技术及应用 一、微生物的基本培养技术1.研究和应用微生物的前提（即发酵工程的重要基础）：防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。（P9）2.在实验室培养微生物的要求：(1)为微生物提供合适的营养和环境条件(培养基）。(2)要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来（无菌技术）。（P9）（一）培养基的配制1培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。（P9）2.培养基作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。3培养基的分类（按照物理性质分类）（1）液体培养基：不含凝固剂（如琼脂），呈液体状态。用途：扩大培养获得大量菌种、常用
2、于工业生产。（2）固体培养基：含凝固剂（如琼脂），呈固体状态。【琼脂固体培养基是实验室中最常用的培养基之一，微生物在琼脂固体培养基的表面或内部生长，可以形成菌落。】用途：分离、计数、鉴定等。了解：琼脂仅作为凝固剂，不为微生物的生长提供能量和营养。菌落指一个微生物细胞繁殖而来的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。培养基的分类（按照化学成分分类）（1）天然培养基：含化学成分不明确的天然物质。用途：工业生产。（2）合成培养基：培养基成分明确。用途：分类、鉴定。培养基的分类（按照用途分类）（1）选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长。用途：培养、分离出特定微生物。微
3、生物对培养基的需求乳酸菌添加维生素霉菌将培养基一般调至酸性细菌将培养基一般调至中性或弱碱性（注意：乳酸菌喜酸性条件）厌氧微生物提供无氧的条件（2）鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物。用途：鉴别不同种类微生物。4.培养基的基本成分：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。（P10）（1）碳源:提供碳元素的物质。分类:无机碳源，如CO2、CO32-、HCO3-等。有机氮源，如葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。适用范围（一般情况下）添加无机碳源培养基用来培养自养微生物；添加有机碳源培养基用来培养异
4、养微生物。【自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源。】了解：牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含糖、维生素和有机氮等多种营养物质。牛肉膏蛋白胨培养基可以培养细菌。牛肉膏由新鲜牛肉经加工制成。蛋白胨用肉、酪素或蛋白质加工制成。（2）氮源:提供氮元素的物质。分类:无机氮源，如N2、NO3-、NH3、NH4等。有机氮源，如牛肉膏、蛋白胨、尿素等。适用范围（一般情况下）不添加氮源培养基可用来培养固氮微生物。思考1：为什么培养基需要氮源？培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。思考2：含C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。思考3：无机氮源能给自养型微生物提供能
5、源吗？可以，例如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）。注意：硝化细菌的碳源为CO2【培养基中不用加入碳源】；氮源为NH3；能量来源为的NH3氧化；根瘤菌的碳源为糖类等有机物，氮源为N2【培养基中不用加入氮源】，能量来源为有机物。思考4：是否所有培养基中都必须添加碳源、氮源？不是，例如分离固氮菌不需要额外添加氮源，其可以直接利用空气中的氮气。思考5：无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，还能有什么功能？有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）有些无机盐离子可以激活某些酶（如Mg2+激活DNA聚合酶）（二）无菌技术1获得纯净的微生物培养物的关键：防
6、止杂菌污染。无菌技术应围绕如何避免杂菌的污染展开。（P10）2.无菌技术主要包括消毒和灭菌。思考：无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。3.无菌技术工作两个方面：对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。（P10）4.做好消毒灭菌工作后，要注意：实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。（P10）为避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。【酒精等的火焰附近是无菌区域，在酒精灯的火焰附近操作，可以避免周围环境中微
7、生物的污染】5.消毒:是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。（P10）了解：生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中部分微生物的方法。例如，有些微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。方法：a.日常生活中经常用到煮沸消毒法，操作方法：100 煮沸56min；b.对于一些不耐高温的液体如牛奶，可使用巴氏消毒法，操作方法：6265消毒30min或8090消毒30s-1min；c.生物活体、水源等还可使用化学药物进行消毒，操作方法：用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等；分析：酒精消毒的最适范围是体积分数为70%-75%的酒精。原因：酒
8、精浓度过高时，菌体表面蛋白质变性过快，从而凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中，酒精浓度过低时，杀菌能力减弱。d.接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射，操作方法：紫外线照射30min。（P11）注意：用紫外线进行消毒时，可以怎么做来加强消毒效果？照射前，适当喷洒酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液。6.灭菌:是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。（P10）拓展：芽孢是某些细菌生长到一定阶段，在细胞内形成的休眠体。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。孢子是某些微生物的繁殖体，有些孢子通过细胞壁的加厚和积贮养料来抵抗不良环境条件方法:a
9、.培养基、培养皿等一般用湿热灭菌法，其中高压蒸汽灭菌的效果最好，操作方法：高压蒸汽灭菌锅内, 以水蒸气为介质，灭菌条件为压力100kPa、温度121、时间15-30min。思考1：使用高压蒸汽灭菌锅时，能不能直接密封升温？不能，一定要将锅内冷空气彻底排出，才能密封升温，否则，可能引起锅内压力达到设定值而温度不能达到要求。思考2：高压蒸汽灭菌锅灭菌完毕后，可以立刻放气减压吗？不能，若立即放气减压瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢，甚至导致容器爆裂（须待灭菌锅内压力降至与大气压相等后才可打开排气阀开盖）。b.耐高温的和需要保持干燥物品，如玻璃器皿、金属用具等，可以用干热灭菌法，操作方法：使用的仪器
10、为干热灭菌箱，以热空气为介质，灭菌条件为温度160-170、时间2-3h。c.接种过程中，微生物的接种工具、试管口、瓶口通过灼烧灭菌法来灭菌，操作方法：将需灭菌的用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，优点是可以迅速彻底地灭菌。（三）微生物的纯培养1培养物概念：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。（P11）2.纯培养物概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。（P11）3.纯培养概念：获得纯培养物的过程。（P11）区别：纯化指从含有多种微生物的样品中获得单一微生物的操作过程。如用选择培养基经过多
11、次纯化培养，从众多微生物中获得的单一微生物的过程。 纯培养指获得由单一个体繁殖的微生物群体（纯培养物）的过程。如酵母菌的纯培养，是用酵母菌培养液，通过平板划线法培养酵母菌获得单菌落的过程。步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。（P11）酵母菌的纯培养操作步骤：马铃薯琼脂培养基培养酵母菌等真菌制备培养基：计算称量溶化调pH定容灭菌倒平板原理：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。（P12）4.菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。一个单
12、菌落即一个种群。（P12）菌落通常可以用来作为鉴定菌种的重要依据。因为不同微生物形成的菌落具有不同的特征，如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。5.培养基的灭菌方法高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）；培养皿的灭菌方法干热灭菌（也可用湿热灭菌法）。6.操作过程中注意事项问答倒平板时使培养基冷却到50左右，在酒精灯火焰附近倒平板。（P12）培养基灭菌后为什么要冷却到50左右时开始倒平板？琼脂是一种多糖，在44以下凝固，倒平板时，若低于50不及时操作，琼脂会凝固。为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？避免杂菌污染。拔掉瓶塞后为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物
13、污染培养基。在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？不能。为什么？因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。倒平板时，能将培养皿的皿盖拿下来放在一边吗？不能。应如何做？用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙。为什么？防止杂菌污染培养基。刚倒完平板，可以直接倒置吗？不能，应等培养基冷却凝固。平板冷凝后，为什么要将平板倒置？防止皿盖上冷凝的水珠落入培养基造成污染，避免培养基水分过快蒸发。怎么确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？将未接种的空白培养基放入37的恒温箱中培养12h24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底
14、(该操作也可确定培养基灭菌是否彻底）。未接种的培养基直接培养起什么作用？做空白对照，判断培养基是否被污染，判断培养基灭菌是否彻底；若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。若未接种的培养基表面出现菌落，说明了什么？说明培养基被污染，实验组的菌落中可能存在杂菌。划线工具接种环。灼烧后的接种环可以直接划线吗？不可以。应如何操作？待接种环冷却后再划线。为什么？避免温度过高杀死菌种。从第二次划线开始，都应从上一次划线的末端开始往下一区域划线。目的是什么？使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落（课本：将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，经数次划线后培养，可
15、以分离得到单菌落）。连续划线的目的：将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。划线注意事项：不要将最后一区的划线与第一区相连。每次划线首尾不能相接。每次划线前接种环进行灼烧灭菌。最后一次划线结束也应该进行灼烧灭菌。划线时要注意不能划破培养基【一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。】整个操作中灼烧接种环的不同目的：取菌种前：杀死接种环上原有微生物，避免接种环上可能存在的微生物污染菌种。每次划线前：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端。接种结束后：及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。平板划线法过程中，接种环蘸了1次菌液；若分五个区划线，则接种环共需灼烧6次；【最多五个区域】培养基中微生物数目过多或连成一片的原因可能是什么？ 菌液浓度过高；培养过程中被杂菌污染；利用接种环划线时，每次划线前未灼烧接种环灭菌。培养酵母菌：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板（一般做三组，目的：平行重复实验）和一个未接种的平板倒置，放入28左右（
