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1、.细菌形态理化鉴定1形态学特征22生理生化特性实验21、尿素酶Urease试验22、氧化酶O*idase试验33、过氧化氢酶的测定34、甲基红Methyl Red试验45、V-P试验46、含碳/氮化合物的利用47、葡萄糖的氧化发酵试验O-F实验58、糖或醇类发酵试验69、硝酸盐Nitrate复原试验710、靛基质Imdole试验吲哚试验711、三糖铁TSI琼脂试验812、氨基酸脱羧酶的测定813、硫化氢H2S试验814、柠檬酸盐或丙酸盐的利用915、利用丙二酸盐试验916、葡萄糖酸盐的氧化918、-半乳糖苷酶ONPG的测定1019、耐盐性试验1020、卵磷脂酶的测定1021、石蕊牛奶的反响11
2、22、酪素水解试验酪蛋白水解1123、酪氨酸水解1224、苯丙氨酸脱氨试验1225、产糊精结晶试验1226、从甘油产生二羟基丙酮1227、厌氧硝酸盐产气1228、马尿酸盐水解试验1329、对叠氮化钠的抗性1330、氰化钾试验1331、对溶菌酶抗性的测定1332、在营养肉汤上的生长1333、需氧性试样1434、明胶Gelatin液化试验1435、淀粉水解试验1436、生长温度的测定1537、形成芽孢的培养基1538、O/129的敏感性试验151形态学特征培养到24h后观察平板上单菌落形状、大小、颜色与突起特征。光学显微镜观察菌体的形态、大小、运动性等。取无油迹的干净载玻片，滴上一滴无菌蒸馏水，用
3、接种环挑取少许菌苔，于水滴边缘轻轻涂几下。自然风干，在火焰上通过几次，固定涂片。滴加结晶紫液，染1min，用水冲净结晶紫液。滴加碘液冲净残水，并覆盖约lmin。用水冲去碘液，将片上的水甩干。滴加95%乙醇液脱色约20-30s，并立即用水冲净乙醇。用番红液染l-2min。用水洗净番红，风干，用显微镜油镜观察涂片。取培养24h左右的菌体涂片、枯燥、固定。滴加3-5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿使沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从冒蒸汽时开场计时约4-5min。倾去染液，待载玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。用蕃红水溶液复染lmin
4、，水洗。待枯燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。按常规取菌涂片，空气中自然枯燥。用1%的结晶紫水溶液染色2min。以20%的硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。干后用油镜观察。菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。2生理生化特性实验1、尿素酶Urease试验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不管底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为。试验方法：挑取1824h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于361培养10，60和120min，分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作
5、变色对照。培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。培养基配制方法：蛋白胨：1 g ；NaCl：5 g ；KH2PO4 ：2 g ；葡萄糖 1 g ；琼脂：15 g；酚红：0.012g；蒸馏水 1000 ml。除酚红外，溶解上述成分，并调节PH为6.86.9，然后参加酚红指示剂，使培养基呈橙黄色，分装，115灭菌20min。待培养基冷至50左右，参加预先过滤除菌的20%尿素水溶液，使其终浓度为2%。试验方法：挑取1824h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培养14d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红色为阳性。2、氧
6、化酶O*idase试验氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反响。试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂12滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。本卷须知：（1） 盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。（2） 铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反响，假设用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒或牙签来挑取菌苔。（3） 在滤纸
7、上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反响时间，造成假阴性。3、过氧化氢酶的测定过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解水和氧。1 试剂：310过氧化氢H2O22 菌种培养：将测试菌种接种于适宜的培养基斜面上，适温培养1824h。3 试验方法：取一干净的载波片，在上面滴1滴310的H2O2，挑取1环培养1824h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，假设有气泡氧气出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。也可将过氧化氢溶液直接参加斜面上，观察气泡的产生。4 本卷须知：过氧化氢酶是1种以正铁血红素作为辅基的酶，所以测试菌所生长的培养基不可含有血红素或红血球。4、甲基
8、红Methyl Red试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至以下，使甲基红指示剂变红。挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于361C或30C以30C较好35天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂12滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.46.0，其pK值为5.0。故在pH5.0以下，随酸度而增强红色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下
9、接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。5、V-P试验*些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP+反响。通用培养基配制方法：蛋白胨5g；葡萄糖5g；NaCl /(K2PO4-一般仅用于肠杆菌各菌属鉴定):5g；蒸馏水：1000mL；PH:7.07.2，分装试管，毎管装约45cm，115灭菌20min。试剂：40%NaOH(或KOH)，6% a-萘酚。试验方法：将试验菌接种于上述培养基，于361C培养4天培养48-96小时，培养液2ml先参加1ml
10、a-萘酚2-na-phthol纯酒精溶液，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动25min，阳性菌常立即呈现红色，假设无红色出现，静置于室温或361C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性.本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。6、含碳/氮化合物的利用细菌能否利用*些含碳化合物作为唯一碳源，反映该菌是否产生代谢这种化合物的有关酶系，因而作为鉴定依据。测定的根底培养基配方很多，因种而异。现介绍1种合成的根底培养基，有些细菌还可适当补加各种维生素。培养基可制成液体，分装试管，也可制成固体平
11、板。可用于测定的底物种类很多，有单糖、双糖、糖醇、脂肪酸、羟基酸及其他有机酸、醇、各种氨基酸类胺类以及碳氢化合物等。糖的含量一般为1，醇类酚类等的含量一般为0.10.2，氨基酸的含量一般为0.5。因碳氢化合物不溶于水，可在液体培养基中振荡培养，或参加到45的固体培养基中，振荡后立即倒成平板。有些底物不宜用高压灭菌，可用过滤法灭菌后参加已灭菌的根底培养基中，*些醇类和酚类不必灭菌。接种和观察结果：菌种最好做成悬液，防止带入少量碳源干扰试验结果。平板培养用接种环点种，液体培养则用直针接种。每一测定菌必须接种未加碳水化合物的空白根底培养基作对照。适温培养2、5、7天后观察，凡测定菌在有碳水化合物的培
12、养基中生长情况，明显超过空白培养基的生长量为阳性，否则为阴性。假假设两种培养基上生长情况差异不明显，开在同一培养基上连续移种3次，如差异仍不明显则以阴性论。(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、木糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、纤维素粉、甘油、甘露糖。)1菌株对碳源的利用Mandel盐营养液54：NaNO32.0g/L，K2HPO4 1.5g/L,CaCl2 1.5g/L,MgSO4 0.3g/L,Mandel盐营养液+2%琼脂+2%碳源。碳源分别为：葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨水培养基1000mL糖发酵培养基：1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1-2mL，另配20%糖溶液10mL调节pH7.6，115灭
13、菌30min，备用。木糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、纤维素粉、甘油、甘露糖。每支试管内装10mL培养基，制成斜面培养基,无菌下接种，每种碳源接种二管，一支不接种做对照，31培养。连续3代移种，生长者为阳性。2菌株对氮源的利用无氮的Mandel盐营养液+2%琼脂上铺无菌滤纸+1%不同的氮源。氮源分别为：NH4+、NO3-、蛋白胨、酵母膏、尿素，每种氮源制三个斜面，其中一个做对照，无菌条件下接种，31培养4d，观察结果。7、葡萄糖的氧化发酵试验O-F实验在细菌鉴定中，糖类发酵产酸是1项重要依据。细菌对糖类的利用有2种类型：1种是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最终受氢体，称发酵型产酸；另一
14、种则以分子氧作为最终受氢体，称氧化型产酸。前者包括的菌种类型为多数。氧化型产酸量较少，所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和，而不表现产酸。为此，Hugh和Leifson提出一种含有低有机氮的培养基，用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵型产酸。这一试验广泛用于细菌鉴定。一般用葡萄糖作为糖类代表。也可利用这一根底培养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力。1接种 ：以1824h的幼龄菌种，穿刺接种在上述培养基中，每株菌接4管，其中2管用油封盖凡士林：液体石蜡1：1混合后灭菌，约加0.51厘米厚，以隔绝空气为闭管。另2管不封油为开管，同时还要有不接种的闭管作对照。适温培养1、
15、2、4、7天观察结果。2结果观察：氧化型产酸仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱12d，后来才稍变酸。发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。8、糖或醇类发酵试验原理：不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解*些糖醇、苷产酸符号：+、产气符号：，培养基由紫蓝变黄指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果，并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类符号：，培养基仍为紫蓝色。培养基配制：一般细菌常用休和李夫森二氏培养基：蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ，NaCl:5g ，糖醇、糖苷：1% ，水洗琼脂：56g，蒸馏水：1000mL，PH:6.87.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。芽孢杆菌培养基配制：(NH4)2HPO4:1g ，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ，酵母膏：0.2g ，糖醇、糖苷：1%水洗琼脂：56g ，蒸馏水：1
