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1、 普通生物学实验报告实验名称：用PCR扩增的方法鉴别不同物种来源的肌肉一、特异性目的片段DNA的扩增（一）实验原理 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，其基本原理为DNA的半保留复制。PCR技术由高温变性模板 ；引物与模板退火；引物沿模板延伸这3步反应组成一个循环，通过多次循环反应，目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将模板DNA置于高温下（通常为93-94），使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因的两条单链互补结合；热稳定DNA聚合酶（Taq酶)在72将单核苷酸从引物的3
2、端开始掺入，以目的基因为模板按5 3的方向延伸，合成互补链。本实验采用物种特异性引物扩增的方法来鉴定3种不同物种来源的肌肉。以不同物种来源的动物DNA为模板，用物种特异性的引物进行PCR扩增，只有在模板和引物的物种相对应的情况下才会有特异性条带的出现。应用此方法，可以特异性地检测样品中痕量的特定DNA成分。（二） 实验步骤1. 不同反应体系的配制按下表将各成分分别加入一做好标记的无菌PCR管中，配制50l的PCR反应体系，注意酶要最后加，加完后将PCR管放置在冰上。10PCR缓冲液5l5l5l5l5l5ldNTP mix(2,5mM each)4l4l4l4l4l4l模板DNA12l2l _
3、_ _ _DNA2 _ _2l2l _ _DNA3 _ _ _ _2l2l引物Pork1(10M）2l _2l _2l _Pork2(10M）2l _2l _2l _Beef1(10M） _2l _2l _2lBeef2(10M） _2l _2l _2lTaq酶（5U/ l）0.25l0.25l0.25l0.25l0.25l0.25lddH2O34.75l34.75l34.75l34.75l34.75l34.75l2. 将上述混合液稍加离心，约10s左右。取下后立即置于PCR仪中，盖紧热盖，定好PCR仪的反应程序，执行扩增程序。反应程序为： 预变性 94 5min 变 性 94 5s 退 火
4、50 5s循环30次 延 伸 72 20s 后延伸 72 5min3.反应结束后，终止程序，将PCR管取出，放置于4，待电泳检测。二、水平式琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物（一）实验原理 核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液（pH 8.0-8.3)中，其碱基不解离，而磷酸集团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子。使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。（二） 实验步骤1. 制胶称取2.4g琼脂糖，放入250ml的锥形瓶中
5、，加入120ml1TAE缓冲液，微波炉高火加热约40s直至沸腾，摇动，使琼脂糖分散，在重复煮沸2次，直至溶液澄清透明。待琼脂糖温度降到60左右时，按1:20000的浓度加入Golden View,混匀后倒入已插上合适齿孔梳子的模具中，静置，约30-45min后凝胶完全凝固。轻轻的垂直拔出梳子，将凝胶取出，放入电泳槽中，添加1TAE缓冲液至刚好没过凝胶（有样品孔的一端靠近负极）。2. 加样取15lPCR产物与3l的6上样缓冲液混匀，加入到凝胶样品孔中。每加完一个样品应更换一个吸头。加样前，要记下加样的顺序。在每排样品孔中留出一个位置加入5l的marker。3. 电泳加样后的凝胶板立即通电进行电泳
6、，电压100V，样品由负极向正极移动。当溴酚蓝移动到距离凝胶下缘约1/3时，停止电泳。4. 拍照电泳完毕后，取出凝胶，采用凝胶成像系统拍照保存。三、 实验小结（一）实验结果 PCR 产物电泳结果由上图可以看出，样品1和样品6出现了目的条带 （大小约200bp），所以DNA模板1为猪肉DNA，DNA模板3为牛肉DNA,DNA模板2为兔肉DNA。（二） 实验讨论1. 在加入Taq酶时，应始终保持酶在冰浴中，不可握在手中。2. 每加完一次酶，都应更换吸头。因为在加酶时，吸头会插入液面以下，为防止污染，应更换吸头。3. 拔出梳子时，应两端一起用力，垂直，缓慢地拔出，以免破坏胶孔。4. 将样品与上样缓冲液混合时，要反复吸进，挤出溶液。为防止出现较多气泡，在每次挤出溶液时，可在吸头中残留少量溶液。5. 在加样时，吸头要垂直于凝胶板且不要插入太深，以免破坏样品孔。6. 我们组的电泳图中，条带不是很明显，应该是加样时样品的量不够充足，以后应注意。
