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1、C型产气荚膜梭菌-2-1融合蛋白的免疫原性研究 作者：韩学波，于欣，廖国玲，谢琴，曾瑾，王玉炯【摘要】 目的 研究含-2-1融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)的免疫原性。方法 用重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)制备包涵体和全细胞培养物两种抗原，采用氢氧化铝胶体作为免疫佐剂，免疫ICR小白鼠，用C型产气荚膜梭菌外毒素粗提物进行攻毒，观察小鼠的保护情况。结果 包涵体加氢氧化铝凝胶制备的抗原保护效果对于1LD100和2LD100的攻毒均达到100%；全细胞培养物加氢氧化铝凝胶制备的抗原保护效果对于1LD100和2LD100的攻毒达到50%和20%。结论 已获得
2、具有一定免疫原性重组菌株，可作为预防C型产气荚膜梭菌所致疾病的候选菌株。 【关键词】 C型产气荚膜梭菌 融合蛋白 免疫保护Abstract：Objective To explore the immunogenicity of alpha toxin、beta 2 toxin and beta1 toxin fusion gene in the recombinant strain BL21(DE3)(pXETAB2BZ)of Clostridium perfringens type C. Methods Inclusion body and the strain culture of reco
3、mbinant strain BL21(DE3)(pXETAB2BZ)were made and the aluminum hydroxide hydrate and Freunds adjuvant were added as adjuvant respectively. ICR mouse was immunized with different antigens and challenged with exotoxin of Clostridium perfringens type C. Immunogenicity of the recombinant strain were obse
4、rved in mice. Results Immunization with inclusion body containing aluminum hydroxide gel could protect ICR mouse from the challenge of 1LD100 and 2LD100. The protective rate of the strain culture containing aluminum hydroxide gel was 70% and 20% from the challenge of 1LD100 and 2LD100 respectively；T
5、he inclusion body and the strain culture containing Freunds adjuvant was 50% and 10% from the challenge of 2LD100 of Clostridium perfingens C type toxin. Conclusion The recombinant strain BL21(DE3)(pXETAB2BZ)had immunogenicity and could be used as candidate strain of vaccination.Key words：clostridiu
6、m perfringens type C；protective antigen；immunogenicitytC型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，又称魏氏梭菌(C1welchii)是一类重要的人兽共患病的病原体，是引起动物出血性、坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌，易导致新生幼畜和幼禽(尤其新生仔猪)高致病性和高病死率。长期以来一直认为C型产气荚膜梭菌只产生主要的毒力因子和毒素(现称1毒素)，并做了许多研究1-5。近年来又发现另一种毒力因子即2毒素6。免疫佐剂是与抗原混合注射于动物体内，能非特异性的改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答的一种物质。本实验将含-2-1
7、融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)优化7后，进一步制备抗原，并配以氢氧化铝胶体作为免疫佐剂，免疫ICR小白鼠，再用C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2外毒素攻毒，观察免疫保护情况。1 材料与方法1.1 菌株 基因工程菌株BL21(DE3)(PXETAB2BZ)系作者8构建和保存；C型产气荚膜梭菌强毒株C59-2由西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室保存。1.2 实验动物1820g ICR小鼠(雌雄各25只)购于宁夏医学院实验动物中心(合格证号 SCXK(宁)2005-0001)。1.3 氢氧化铝胶体免疫佐剂的制备 氢氧化铝200g，氯化钠8.5g，蒸馏水加至1000m
8、L，完全混合均匀后双层纱布过滤2次，1.05105Pa高压灭菌60 min备用。1.4 菌种的复壮在预先准备好的含50mg/mL Kan的LB平板上，接种环划线冻存的BL21(DE3)(PXETAB2BZ)菌种，倒置于37培养箱中培养1216h后，挑取单个菌落，接种于含50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37振荡培养1216h后备用。1.5 免疫用抗原的制备1.5.1 包涵体粗提物抗原的制备将IPTG诱导5h的50mL培养物离心收集菌体，然后重悬于0.5 mL 1% Tris-HCl-2mmol/L EDTA中，加入溶菌酶至终浓度100 g/mL，再加入0.5 mL 1% Triton
9、X-100，于30温浴15 min。超声波处理10 s后再超声波处理10 s，12000r/min离心15 min，收集的沉淀物即为包涵体粗提物。将该包涵体重溶于20 mL的生理盐水中，超声波处理10 s后再超声波处理10 s，12000 r/min离心15 min，收集沉淀重溶于6 mL的生理盐水中，分装于6支离心管中，备用。 将制备的包涵体粗提物1支用灭菌生理盐水10倍稀释后，加入氢氧化铝凝胶至终浓度10%，经无菌检验后作为免疫用抗原。1.5.2 重组菌全细胞培养物抗原的制备挑取LB平板的单个菌落，接种于5mL含30 g/mL Kan的LB试管中，于37振荡过夜。次日取 1mL接种于100
10、 mL含Kan的LB三角瓶中(1%接菌量)，于37振荡1624 h后加入0.8%甲醛灭活3d后，取50mL按10%加入氢氧化铝凝胶佐剂，经无菌检验后作免疫用抗原。1.6 免疫接种实验取小鼠50只，随机分成5组，每组10只(每组雌雄各5只)，第一组和第二组皮下注射用包涵体加铝胶制备的抗原(0.5mL)，第三组和第四组皮下注射含工程菌全细胞培养物加铝胶制备的抗原(0.5mL)，第五组皮下注射生理盐水(0.5mL)作为对照。间隔14d进行二免。二免14d后用C型产气荚膜梭菌强毒株(C59-2)进行攻毒，每天观察小白鼠死亡情况。1.7 C型产气荚膜梭菌毒素的制备 将C型产气荚膜梭菌强毒株(C59-2)
11、接种于肝片肉汤厌氧培养基中，37过夜培养，4 5000 r/min离心20 min后以0.44 m微孔滤膜过滤除菌，即为毒素粗提物，临用前以无菌生理盐水稀释10倍，作为攻毒毒素。1.8 C型产气荚膜梭菌作用于ICR小鼠 LD100的测定将毒素粗提物用灭菌生理盐水稀释10倍后以不同剂量(0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL)分别腹腔注射6组ICR小鼠，每组4只(每组雌雄各2只)，48h后观察各组小鼠的死亡情况，确定ICR小鼠LD100。1.9 攻毒试验将C型产气荚膜梭菌毒素粗提物以1 LD100剂量对第一和第三组免疫小鼠进行攻毒，以2 LD100剂量对第二和第四组免疫小鼠进
12、行攻毒，同时以1 LD100剂量注射对照组小鼠，48 h后观察各组小鼠死亡情况，观察免疫保护效果。2 结果2.1 C型产气荚膜梭菌毒素LD100的测定由表1可以确定C型产气荚膜梭菌强毒株(C59-2)毒素对ICR小鼠的 LD100为0.005 mL(C59-2毒素原液剂量)。表1 C型产气荚膜梭菌毒素LD100测定（略）表2 免疫原性实验结果（略）2.2 重组菌株的免疫原性实验3 讨论C型产气荚膜梭菌属腐生性厌氧芽胞致病菌，在土壤中广泛存在，享有广泛的疫源地，因而对我国畜牧业生产构成严重威胁，全国各地仔猪红痢的发病率呈上升趋势，兼有很高的死亡率。本病的主要致病因子为菌体产生的和毒素，其中2毒素
13、是1997年才确认的一种新的坏死性、致死性毒素6。与1毒素一样，2毒素也是引起人和动物坏死性肠炎的重要致病因子之一。业已证实，2毒素的基因序列与1毒素、毒素及其它已知的产气荚膜梭菌毒素的序列没有明显的同源性，但却有相似的生物学活性9。抗2毒素的抗体能识别纯化的2毒素，并能与1毒素发生弱反应，相反，抗1毒素的抗体只能与1毒素反应，而不能与2毒素反应，表明二者的免疫相关性差，其机理尚不清楚9。而毒素是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶，具有磷脂酶C(PLC)和鞘磷脂酶两种酶活性，能同时水解组成细胞膜的主要成分磷脂酰胆碱和鞘磷脂，破坏细胞膜的完整性，导致细胞裂解，从而具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤
14、坏死性等特性。 结果表明，用制备好的融合蛋白免疫ICR小白鼠后，包涵体加氢氧化铝凝胶的保护效果对于1LD100和2LD100的攻毒均达到100%，表明C型产气荚膜梭菌保护性抗原基因重组菌株BL21(DE3)(pXETAB2B1)能够表达-2-1融合蛋白，并且该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体，从而达到对C型产气荚膜梭菌攻毒保护的目的。全细胞培养物加氢氧化铝凝胶抵抗的保护效果对于1LD100达到50%，2LD100达到20%。全细胞培养物的保护率未达到预期效果，分析原因可能是由于外源基因较大，在不加诱导剂的情况下不能很好的得到表达，且不能很好地释放至菌体外，从而降低了重组菌株的保护率。
15、【参考文献】 1Williamson ED，Titball RWA genetically engineered vaccine against the alpha-toxin of clostridium penfringens protects mice against experimental gas gangreneJVaccine，1993，11(12)：1253-1258.2Hunter SE，Cand Bromwn.E.Molecular genetic analysis of beta-toxin of clostridium penfringens reveals sequence homology with alpha-toxin，gamma-toxin，and leukocidin of staphylococcu sureusJHnfect Immun，1993，61(9)：3958-3965.3Steinthorsdottir V，Fridriksdotti VSite-directed mutagenesis of clostridium penfringen
