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1、烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法标准项目技术报告烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法项目组2019年5月1概述水溶性糖，可降低烟气的刺激性，产生令人满意的吃味1,水溶性糖含量高 的烟叶柔软、富有弹性，色泽鲜明。水溶性总糖和还原糖含量被公认为是体现烟 草品质的指标，是烟草化学分析的重要项目之一 2,3。在烟草行业中，糖类物质分析方法主要有费林试剂法囹、近红外光谱法、 气相色谱法(GC) 6,7.高效液相色谱-示差折光检测法(HPLC-RID) 8-1。和连续流 动法11项等。其中，连续流动法11-13是最常用的水溶性糖检测方法。国内普遍 采用的YC/T 159-2002烟草及烟草制品水溶
2、性糖的测定连续流动法11 是以 烟草科学研究合作中心(CORESTA 38号推荐方法(ISO 15154: 2003)13为基础 建立的，而且该方法是基于AA3型连续流动分析仪进行烟草中水溶性总糖和还 原糖含量测定的。YC/T 159-2002方法可测定水溶性总糖和还原糖，当测定总糖时，95C加热 槽和85C加热槽均使用；当测定还原糖时，95C加热槽不加热，只使用85C加 热槽。由于烟草为植物样本，其萃取液中含有金属离子，而渗析器中的渗析膜是 一个双向渗透膜，因此渗析器下层流路中的氢氧化钠溶液会渗析到渗析器上层， 使渗析器上层流路中液体为碱性，所以当进行样品测试时，随着样品量的增加， 易在渗析
3、膜上产生沉淀，影响渗析效果，峰高会逐步降低，当进样次数达到20 杯以后，会出现渗析膜被沉淀完全覆盖，样品无法渗析，导致无法出峰；ISO 15154:2003 (CORESTA第38号)标准方法渗析器上层及之前的管路里为样品萃 取液和醋酸，可使渗析器上层流路中液体为弱酸性，减缓渗析膜上沉淀的生成， 当进样次数达到40杯以后，随着渗析膜上生成的沉淀增加，会对渗析造成显著 影响，仍然会出现峰高逐渐下降的现象。YC/T 159-2002方法的目标物是在强碱性、85C条件下进行测试，因此YC/T 159-2002方法采用0.5mol/L的氢氧化钠溶液来保证测试环境的强碱性，但是如 氢氧化钠溶液浓度过高，
4、其腐蚀性增强，易使85C加热槽使用寿命缩短，通过 实验研究发现目前YC/T 159-2002方法采用的氢氧化钠浓度可进行适当的降低， 进而延长85C加热槽的使用寿命。连续流动方法对流入检测器溶液的温度要求是要在室温左右，由于还原糖测 试主要反应是85C条件下进行的，因此ISO 15154:2003 (CRM N 38)标准方法 在85C加热槽后采用冷却器和30匝混合圈来达到这个要求；YC/T 159-2002方 法中样品在85C加热槽后至进入检测器之前设置了 20匝混合圈，在实际测定过 程中发现进入检测器溶液温度并不能有效的降到室温左右，而检测器是一个密闭 的空间，随着样品量的增加，检测器温度
5、会逐步升高，从而影响检测结果的准确 性，使数据的可比性下降。质检中心在标准颁布后发现以上问题，并做了大量的实验，探索并形成了目 前行业统一使用的解决方案。考虑到修改后的方法有别于YC/T159-2002标准方 法，而且行业也一直未对该标准进行修订，所以行业内部分实验室有可能还是延 续标准方法进行检测，这样就容易造成检测数据的偏差。进一步降低了数据的可 比性。综上所述，有必要对YC/T 159-2002进行修订。本标准修订后，可使连续流 动测定烟草水溶性糖的方法更为完善、准确，特别是在大样品量检测中排除干扰， 提高检测效率。2标准适用范围本标准规定了烟草及烟草制品中水溶性糖含量的测定一一连续流动
6、法。本标准适用于烟草及烟草制品中水溶性糖含量的测定。3方法原理用5%乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的糖(水溶性总糖测定时应水解) 与对羟基苯甲酸酰肼反应，在85C的碱性介质中产生一黄色的偶氮化合物，其 最大吸收波长为410nm，用比色计测定。4实验方法4.1仪器与设备BRAN+LUEBBE AA3连续流动分析仪；ALLIANCE FUTURA H连续流动分析仪；API305D流动分析仪，SKALAR SAN+流动分析仪；HP8453型紫外一 可见分光光度计（美国HP公司）；BSA2245-CW电子天平（感量0.0001g，德国赛 多利斯公司）；Milli 一 Element超纯水装置（美国M
7、illipore公司）；烘箱（FD115, 德国Binder公司）；振荡器（HY-8调速，常州国华电器有限公司）。4.2试剂和材料D-葡萄糖（98 %,Riedel-de Haen）；冰乙酸（99.5 %，Regent）；盐酸（质量分 数36 %-38 %,烟台双双化工有限公司）：氢氧化钠（98 %，Alfa Aesar）；氯化钙 （95.0 %,天津市瑞金特化学品有限公司）；聚乙氧基月桂醚（Brij-35,上海安妍 生物有限公司）；对羟基苯甲酸酰肼（98%，ACROS），柠檬酸（99.5 %,天津市 瑞金特化学品有限公司）；超纯水（电阻率18.2MQ.cm）；烤烟、白肋烟、香料 烟监控样品（
8、国家烟草质量监督检验中心提供）、3R4F、烤烟型卷烟（由河南中 烟和贵州中烟提供）、混合型卷烟（由北京卷烟厂提供X加热不燃烧样品（由云 南中烟提供）、再造烟叶（由云南中烟再造烟叶提供）以及原料样品（由郑州烟 草研究院提供）共计10个样品。4.3样品的前处理和分析烟叶样品制备参照YC/T31-1996。准确称取0.25g样品至50mL具塞三角烧瓶 中，加入25mL5%醋酸或去离子水，室温下振荡30min后过滤，使用连续流动分 析仪测定，测定管路见图1.1和图1.2。詈,譬.32mL/min空气红/红。.色诚而也 水或1. Diwl/L盐酸红/红口。. 盐酸或水憧/曰口样品黑/黑D.3加L/min
9、空气枣簪CUmol/L 急.氧化讷41CtUR 比色计稻F黄上1 W也/就.：口（1氧化钙图1.1测定烟草中的水溶性糖流程分析图（大流量）鲨，蓝 上况巾京0堂5必妲 口匝 ；一女自丞SZ3膏=n_L口 白/白 l.Cimm /. 0. 2mol/Ll. Omo 1几盐酸土2lU） 橙，蓝 口. NSuun q 样品废液州匝 加匝1D匝散热装置.0.25 空气 ., 檀，绿CL 33响，: 注期曲:紫/紫:离口6硕一 . 4iwl/L氢氧化地.橙/绿 3&皿: 氧化钙41 Onm比色计图12测定烟草中的水溶性糖流程分析图（小流量）5结果与讨论5.1定性分析实验图2不同浓度标准样品的紫外可见吸收光
10、谱曲线图2所示为不同浓度的标准样品的紫外可见吸收光谱曲线。根据反应原理， 通过标准样品的测试结果来建立标准曲线。从图2可以判断光谱的最大吸收波长 为400nm-410nm之间，由于仪器配套滤光片的波长基本都是10的倍数，故本实 验维持原标准的410nm滤光片。5.2萃取剂及萃取时间的选择由于本方法主要是部分试剂的替换和修改，其它试剂保持不变，YC/T 159 -2002烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法的方法在制定过程中已进 行过萃取剂及萃取时间的实验，因此本方法直接采用水或5%醋酸溶液对样品进 行萃取，不再进行萃取剂及萃取时间的实验。5.3盐酸溶液浓度的选择5.3.1 AA3机型实验原标
11、准中规定，当测定还原糖含量时，位于加热槽上层的红/红管路为活化 水，此时渗析器下层流路中的NaOH溶液会渗析到上层，与烟草萃取液反应， 易在渗析膜上产生沉淀，随着样品进样次数的增加生成的沉淀逐渐增加，从而导 致样品峰高逐渐下降，在20杯以后表现尤为明显。本研究中，选择将红/红管路 活化水改为 0.10mol/L、0.20 mol/L、0.30 mol/L、0.50 mol/L、1.00 mol/L 五种不 同浓度HCl溶液测定烤烟监控样品的还原糖含量，样品进样数n=6。结果（图3） 显示,当使用不同浓度盐酸溶液时，其还原糖含量均在标注值范围之内（均大于 最小值），当盐酸浓度低于0.20 mol
12、/L时，烤烟还原糖含量最接近标注值，且与 原标准方法（即盐酸浓度为0）结果无显著差异。随着盐酸浓度的升高，还原糖 含量在逐渐降低，这可能与还原糖于无机酸产生脱水反应，生成5-羟甲基糠醛有 关，这也与前人研究结果一致。烤烟图3不同浓度HCl溶液测定烤烟还原糖含量（a代表0.05显著水平，下同）o o o o o O 0.9.&7.6.5.3 2 2 2 2 2鉴于以上结论，项目组还考察了 0.00 mol/L、0.10 mol/L、0.20 mol/L、0.30 mol/L盐酸浓度的连续进样数。结果（图4）可以看出，当盐酸浓度为0.20 mol/L 和0.30 mol/L时，测定还原糖含量的有效
13、进样数均达到60杯以上，远大于原标 准方法（盐酸浓度为0）的20杯和0.10 mol/L盐酸的40杯，结合成本考虑，故 选择将原标准方法中红/红管路活化水改为0.20 mol/L盐酸溶液，不影响测定结 果，且能极大提高工作效率。5.3.2不同机型验证结果监控样品C10.0 。0系 9.6 -Mo测定值为 9.2 -、00.0SKALARAPIAlliance不同机型监控样品C8.8 1碧 84 -O|。测定值Q 8.0 -7.6 SKALARAPIAlliance不同机型图5不同机型验证实验结果项目组组织了 3家拥有不同机型（SKALAR SAN+、API、ALLIANCE）的连续流动分析仪的
14、实验室对这一条件进行了验证，选用监控样品烤烟（A） 和 香料烟（C）作为样品，结果如图5所示，3种机型的验证结果均在监控样品的 扩展不确定度范围内，均为有效结果。5.4氢氧化钠溶液浓度的选择5.4.1 AA3机型实验yC/T 159-2002方法的目标物是在强碱性、85C条件下进行测试，因此YCT 159-2002方法采用绿/绿管路中0.5mol/L的NaOH溶液来保证测试环境的强碱性， 实际检测中发现如果NaOH溶液浓度过高，易使85 C加热槽使用寿命缩短，本研 究选择 0.15 mol/L、0.25mol/L、0.40mol/L、0.50mol/L（原标准方法）、0.60 mol/L、 0
15、.70 mol/L六种不同浓度NaOH，其他条件不变，测定烤烟监控样中还原糖的含量。 结果见图6和图7。图6可见，与原标准方法（0.5 mol/L）相比，采用0.40 mol/L氢氧化钠溶液的测定结果更接近标注值，且结果无显著差异。结合图7,选择0.40 mol/L氢氧 化钠溶液能较好的维持原标准方法要求的强碱性环境（pH值大于12）。5.4.2不同机型验证结果监控样品A340 33.0 -30.0 -029.0 L=9.2 -监控样品C8.8O8.4 -8.0 -7.6 oO测定值SKALARAPIAlliance不同机型SKALAR API Alliance不同机型图8不同机型验证实验结果项目组组织了 3家拥有不同机型（SKALAR SAN+、API、ALLIANCE） 的连续流动分析仪的实验室对这氢氧化钠溶液浓度进行了验证，选用监控样品烤 烟 （A）和香料烟（C）作为样品，结果如图5所示，3种机型的验证结果均在 监控样品的扩展不确定度范围内，均为有效结果
