设计引物事例

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1、PrimerPremier 5.0 应用-设计 4CL 同源引物自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来,PCR技术已成为 分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一 ,而引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败。 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列 到特定网页,得到设计好的引物,也可以在本地计算机上运行引物设计 专业软件。一般来说,专门进行 PCR 引物设计的专业软件功能更为强 大,但使用起来却不太容易。1. PrimerPremier5. 0 相关介绍PrimerPremier5. 0用于PCR或测序引

2、物以及杂交探针的设计、评估的 软件，也用于检验所设计引物的 PCR 扩增效率和特异性。 Primer Premier 5 0作为当今引物设计的主流软件，有着操作简便、功能强 大、成功率高等诸多优点。本文结合多位研究者的实验结果对运用 Primer Premier 5 0软件设计引物的经验和教训进行探讨。Primer 引物设计Primer 功能板块包括了设计引物的搜索引擎软件包含了强大的自动 搜索法则只需要简单的操作就可以得到合适的引物PRIMER PREMIER 也提供了人工控制搜索引擎的方法便于根据您的特殊要求制定标准 输出的引物通过全面的即时分析工具计算出引物的多种参数和二级 结构关键参数

3、如 Tm 值 GC 含量和自由能 G 还能以图形显示还有另一 个窗口来显示引物的比吸光度 activity 单位 nmoles/OD 和 ug/OD 及 引物的分子量还可以将当前引物输入数据库打印或填写引物合成定 购单。为设计用于定点突变的引物该项功能板块也提供包括即使分析和限 制性酶切位点分析的引物编辑工具您可以通过输入碱基或氨基酸残 基来手动修改引物为分析多对反应引物如在复式及巢式 PCR 中使用 function 菜单下 Multiplex/Nested 选项，可以分析所有想用到的引物 可以选择事先搜索的引物或手动添加引物软件提供将引物储存到数 据库的功能也提供填写引物合成定购单的功能定

4、购单上会自动填入 引物序列和其他重要信息。该项功能板块由以下部分组成Preferences 参数设置窗口Primer Premier 引物设计窗口Edit Primer 引物编辑窗口Search Criteria 搜索标准窗口Search Parameter 搜索参数窗口Search Results 搜索结果窗口Database 引物数据库窗口Multiplex/Nested Primer 复式及巢式 PCR 引物设计窗口1.1Primer Premier 引物设计窗口Primer Premier 引物设计窗口是分析引物的关键该窗口包括以下功 能即点即选 Direct。1.2Edit Prim

5、er 引物编辑窗口Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析 一条已有引物序列在 windows 系统或 Power Mac 的 Command-X Command-C 及 Command-V 系统中您可以使用 CTRL-X CTRL-C 和 CTRL-V 快捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物序列并从剪贴板 上粘贴是分析一条已有引物的好方法进行粘贴时 Paste 粘贴窗口会 激活用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式您也可以手工 键入引物序列一旦引物被编辑发生变化 Analyze 按钮就可以使用点 击 Analyze 按钮即可分析编辑后的引物您可以修改实际序

6、列或是翻 译后的氨基酸残基如果您修改氨基酸残基相应位置可能出现多义密 码子。1.3Search Criteria 搜索标准窗口根据 PCR 引物测序引物或杂交探针的不同要求选择不同的搜索标准 是很有必要的 PRIMER PREMIER 会根据您的选择来调整自动搜索的 标准某些用以优化引物扩增能力的标准不一定也适合测序引物或杂 交探针的设计这两者需要的是较高的退火温度因此当选择不同的搜 索标准 PRIMER PREMIER 将对相关标准作出调整以适应不同的要求 1.4Search Parameter Windows 搜索参数窗口 搜索可以使用其它的自动搜索方法或者手动搜索当希望搜索的引物 不会与

7、其它存在与反应中序列发生错配您可以在激活False Priming 选项后利用 Files 按钮选择这些序列文件。1.5Search Results 搜索结果当您点击搜索程序窗口的OK按钮接受搜索结果后Search Results搜 索结果窗口将会打开它显示了搜索中找到的所有引物或引物对如果您选择了一条引物或一对引物对在PRIMER PREMIER窗口上将即时显示引物的分析结果与当前的序列配对的引物的位置和序列也会在Direct Select 框上显示。1.6Database 引物数据库窗口 引物数据库可以用来保存引物序列您可以为每一条引物命名并保存 在一个原有的或新建的数据库中在数据库窗口中

8、您可以使用 Order Primers按钮来定购引物。1.7Multiplex/Nested Primer复式及巢式PCR反应引物窗口巢式 PCR 反应通常能大幅提高灵敏度同时又减少非特异性扩增产物 通常在模板 DNA 浓度太低或不纯时采用您可以使用自动搜索或按您 实验的需要搜索然后从中选择一系列合乎要求的引 物 PRIMER PREMIER可以确认它们是否会形成二聚体来帮助您选择巢式PCR反应 引物。当接受搜索结果选择菜单 Function Multiplex/Nested Primers 选项即 可打开该窗口所有引物与全序列以图形显示在窗口顶部序列上的框 架代表窗口中间放大显示的部分序列所

9、在的位置通过拖动横行滚动 条可以改变放大显示的区域所有提供的引物以竖线形式在顶部 的图框显示以蓝色三角形或红色三角形在下面的放大框中显示蓝色 代表正向引物红色代表反向引物。2. 设计同源引物步骤 现在克隆一条完整的基因有很多方法。比如同源克隆、电子克隆等方 法，下面我们介绍同源克隆法的设计引物的步骤。在NCBI内找到一 个杂交杨的4CL的一个全长基因，来设计同源引物用于克隆青杨中的 4CL 基因的一个方法。2.1 材料和方法通过在NCBI内找到一条完整的杂交杨的4CL基因，保存并复制下来。 并记录下其CDS为7-1629用于后面的设计。2.2将在NCBI中到的杂交杨的4CL全长序列为模板。将序

10、列全部复制进入Primer Premier 5 0软件，此软件需要用键盘进行粘贴操作。并点击左上角的邑豐1进行下一步操作。图1.序列粘贴进Primer Premier 5 0界面2.3点击Primer键后出现如图界面，接着点击左上角第二个键Search图 2. 点击 Primer 键后出现的界面2.4点击Search后，出现了设计过程中最重要的界面，此界面是关于参数的设计。图 3.参数设计界面Search For 选择 PCR Primers。Search type 选择 Paris。Search Ranges：Sense Primer 默认为1 到模板序列的长度，在此为1到 1862。Ant

11、i-sense Primer 默认为1到模板序列的长度，在此为1到 1862。PCR Product Size 为了获得一条完整的序列，我们设定的最小值应该是 模板的起始密码子到终止密码子的序列长度。如模板的CDS为7-1629, 那么最小值应该是 1629-7=1622，大于或是等于1622，最大值的取值 为模板的序列全长长度1862.因此可将此参数框设置为1622-1862。Primer Length 我们一般设计的引物长度为18到24个碱基的长度。 可使用界面中默认值。Search Mode选择Automatic,选择一个自动用于引物的筛选。设置完所有参数后点击左最下面的* I键入下一个

12、界面。Search ProgressSearch Complete.Primer Search Results:Remaining RejectedTotal PossibleTmGC%Degeneracy囂 End StabilityGC Clam|ReduiHlniicyRep eats .RunsDinier.HairpinFalse PrimingO|rtimal PrimersStringency:Sense:Aurti-eiise:fl凰凰回回回Very HigliHigliMode ratLowVery LowManualPrimer Pairs:|画| Pairs Found1

13、00图 4 点击 OK 键后的 Search Progrgress 界面出现此界面后点击右上方的71进入下一个界面。2.5 点击 OK 键后出现了 Search Results 的界面。图 5.Search Results 界面对于结果的选择我们要注意很多，第一是Tm值得选择，在PCR里我 们一般要求的退火温度在55C到60C。图 6 选择的第一对引物结果从图中可看见两条引物的的Tm值为52C和51.3摄氏度。不是很适 合退火温度。最下面一栏的 Hairpin 是显示引物是否形成发夹结构，Dimer看因为是否形成二聚体，False Priming是显示引物是否错配，在这些情况下，出现None表

14、示没有发现这些结构或是错配以及形成 二聚体。出现红色字体Found表示发现这些结果。我们设计的原则是 尽量出现少的红色Found。依次往下选择引物最重要的原则是，选择的正向引物应该位于其实密码子的上游，那么 反向引物应该选择位于终止密码子的下游，这样才能保证一条完整的 产物序列被扩增出来。2.6导出设计的引物，点击主菜单内的 Function 的 Save to Datebase。图7 导出的引物结果图图中最下面为正向和反向引物的碱基序列。将两条因为摘抄下来送至公司进行合成。3. 讨论引物设计不仅是 PCR 的第 1 步，更是使其成功扩增的关键一步，好 的引物不但能避免背景和非特异物的产生，而

15、且也能识别cDNA和基 因组模板。由于基因克隆成功关键步骤就在于 PCR 反应，扩增产物 必须要具备高效性、特异性，所以只有科学严谨地抓住引物设计的每 个环节，才会得到最理想的结果。 当然，设计特异性引物虽然有自身的一些规律可循，但是有较大的不 确定和偶然性，设计者只有查阅大量的文献，积累足够多的经验并不 断探索，才能取得满意的结果。在该文中涉及到的所有生物分析软件 的计算结果只是在软件所规定标准状态下的推理结果，必须要预先查 看一下软件帮助中设计的环境要条件要求。在实际状态下，由于核酸 杂质、有机物质浓度、ph值、离子种类和浓度等很多因素影响，且 核酸杂交也不是机械地对应杂交，它们只会按照最有利于自身杂交的 状态去反应。因此，通常情况下，实际杂交状态是不可预知的，会存 在许多未知性和不确定性。 当今，随着生物信息学蓬勃的发展趋势，在以后的分子生物学探索中， PCR 技术将会被研究的愈来愈透彻、愈来愈深入，核苷酸引物设计也 必将趋于简便、灵活、系统、完善。