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1、2022年宏基因组测序mNGS临床应用进展(全文)推荐理由感染性疾病的病原体种类多样，除常见的病原体外，罕见细菌、病毒、真 菌及寄生虫等病原体不易被传统的方法检测，给临床诊断带来困难，导致 漏诊和延误，或造成抗生素药物的滥用。近年来，随着测序技术的飞速发 展，二代测序(next-generation sequencing，NGS)技术已逐步应用 于感染性疾病的诊断、治疗和监测。宏基因组测序(metagenomics next generation sequencing，mNGS)技术是对样本中所有核酸进行无偏倚 测序，结合病原微生物数据库及特定算法，检测样本中含有的病原微生物 序列，在病原微生
2、物的鉴定、分型、耐药突变检测及新型病原体鉴定等方 面具有独特的优势和吸弓|力。早在2014年，美国Charles Chiu教授首次应用mNGS技术诊断了一例 神经系统钩端螺旋体病例1,而这类疾病依靠常规检测方法是难以检出 的，此次应用证实了 mNGS技术在病原微生物鉴定领域，尤其是疑难微 生物鉴定方面的应用潜能。随着该技术的社会经济成本不断降低和技术的 不断完善，mNGS已逐渐从科研走向临床应用，成为临床疑难和未知病原 微生物检验的重要手段。202。年12月13日，复旦大学附属中山医院感 染病科的胡必杰教授团队在Small Methods上(IF=12.13 )发表了一篇 题为High-Thr
3、oughput Metagenomics for Identification of Pathogens in the Clinical Settings”的综述，对高通量测序技术在感染病 原检测方面的应用进行了详细地阐述，特摘综述的部分节选，以飨读者。高通量测序技术在临床诊断的应用REVIEWsmall伽函mbHigh-Throughput Metagenomics for Identification of Pathogens in the Clinical SettingsNo 2 Qixg中飓 Car, Qing 讪皿 Zes hi Song,比距trnd Bijiff高通量测序技术发
4、展历程2测序技术面世至今，测序技术和测序平台不断更迭，而且测序读长不断加 长、通量不断提升、时间不断缩短。1977年出现了以Sanger测序技术3 为代表的一代测序，其主要特点是测序读长长（可达1000bp），准确性高。 然而，一代测序由于测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真 正大规模的应用。现阶段，二代测序（NGS）技术大大降低了测序成本，大幅提高了测序速 度，并且保持了高准确性。但是，NGS存在序列读长短、后续的分析依赖 于片段拼接可能影响准确度以及测序运行时间较长的问题。因此，二代测 序仍有改进的空间。三代测序技术又称单分子测序技术，与NGS相比，三代测序技术每秒可 检测10个
5、核苷酸大大缩短了测序时间。此外三代测序可实现DNA/RNA 直接测序、无需PCR扩增以及无GC偏好性的优点。尽管第三代测序具有 诸多优势，但由于其错误率高、成本高，目前仍未在临床应用中得到广泛 应用。平台方法I读长（bp）方式就势劣势二倾序dlluiminia MlSeq边台成边湖序1SD.25DPE便犬相对戏式欢序运行时间命，通量低lllurnina N0KtSeq5OO/55O75.150 SE, PE 测序运行时间 1，网虾 谟甑短!lllumina HiS&q 4000125J50PE通量高，该妖长测序寇有时间lllunina No皿钮q 600150PE 通筮高,议长长测序运行时间耳
6、UHBG1SEQ-50联合睬钎镉定艇合技术 :驴AS和改iSBlDNA笔X球（DNB）50SE窿本低，状岸匿疗器 械注册证读长赣50SE 成本位100PE成本假，在宥院疗器植注田证三代;TI序PacBio Sequel单分手实时测序SMRTJ M.SkbSE精确座锹，成本毫Oxfqfd Nanopare MinlON纳米孔剖序技术/1D 读径长观序速度快 精确度氾成本SS表1.病原微生物高通量测序平台参数汇总2高通量测序检测流程mNGS分为两个技术环节，即实验操作环节（也称湿实验”），和之后的 生物信息学分析环节（也称干实验湿实验包括临床样品处理、文库制 备和测序步骤；而之后的生物信息学分析是
7、mNGS中的重要部分，是对 测序产生的原始数据进行处理和分析，包括但不限于数据质控、人源序列 比对过滤、微生物物种鉴定等过程2。所以就具体操作流程而言，mNGS 主要包括对待测样本进行核酸提取（DNA提取和RNA反转录）、文库构 建、上机测序、数据处理和结果解释等步骤4。图1. mNGS在临床应用中的测序流程2Clinical evaMatknGastrointestinal system (Gastncjuce. Intestinal juice)Urmaiy system (Urine)Musculoskeletal system(Arthrohydrops. Tissue)Reprodu
8、ctrve system(Vaginal discharge Prostatic Hud)Sputum liquefacton Sample preprocessingFFPE Sample dewaxingHuman DN A removalDMA enzymeNEB Microb)ofne Kit treatment咐 X/WX/VX/dna xy/x/x/。Library PreparabonO SequencingO ReportAnbbobc r05*$tence geneimNGS在不同系统感染中的应用血液系统感染近十年间，对引发脓毒症的感染病原体研究发现，各种感染性病原体在脓 毒
9、症中所占的比例不同，尽管由革兰氏阴性菌、厌氧菌和真菌感染导致脓 毒症的报道屡见不鲜，但是革兰氏阳性菌仍然是最常见病原菌。然而，目 前仍有约50%的脓毒症患者其致病菌不明确，即培养阴性脓毒症。尤其是 急性感染和重症脓毒症患者如未能及时进行有效的抗生素治疗，则病死率 高，此类患者急需在短时间内明确致病病原菌。因此，临床迫切需要快速 和灵敏的病原微生物诊断技术。多个病例报告和研究表明，血浆中循环或非循环病原体的无细胞病原体 DNA或RNA可能与感染有关，mNGS技术通过对血液样本中的游离 DNA(cfDNA)或游离RNA(cfRNA)进行测序，可鉴定病原体。多项研究报 道提示，mNGS与血培养结果的
10、一致性达93.7%，在鉴定脓毒症致病菌 方面比其他检测方法更有效。而且，mNGS测序总体检测阳性率高于培养， 可以识别出传统培养方法遗漏的潜在细菌病原体。值得注意的是，虽然健康人血液通常被认为是无菌环境，但偶尔也能检测 到细菌DNA，尽管如此，健康人与脓毒症患者血液病原菌的组成还是存 在显著差异。研究表明，在健康人血液中检测到厌氧菌居多，其中大多数 是双歧杆菌类细菌，而脓毒症患者血液中，大部分为需氧或微需氧微生物。 因此，虽然在健康人血液中检测到细菌DNA，提示细菌进入血液系统中， 但其并不总是导致败血症。上述研究结果有助于对疑似脓毒症患者mNGS 检测结果的解读。综上所述，mNGS对病毒、结
11、核、厌氧菌、真菌和寄生虫，以及混合感染 诊断方面优势明显，对抗菌药物的治疗方案具有指导意义，可以有效避免 血流感染患者的抗生素滥用，与此同时，mNGS检测时间可缩短至24小 时，大大提高患者生存率。中枢神经系统感染2感染中枢神经系统的病原体种类多样，其症状包括脑膜炎、脑炎和脓肿， 往往威胁患者生命。然而，传统病原体检测方法尚不能有效涵盖临床感染 性疾病的病原谱，尤其是罕见病原体。此外，CNS感染性疾病确诊的依据 在于从脑实质或脑脊液（CSF）内检测到病原微生物，但是由于脑脊液和 脑组织样本取材相对困难，且标本量小，限制了 CNS感染性疾病病原体 的检出。因此，CNS感染患者往往未能查出病因，尤
12、其在急性脑膜脑炎患 者中高达50%，临床迫切需要快速、准确的诊断技术。近十年来，mNGS在临床感染性疾病的诊断中显示出了极大的潜在价值。 目前已有多个病例报道应用mNGS技术从脑脊液和脑组织中鉴定出病毒、 细菌、真菌、寄生虫等，并表明mNGS在诊断难度较大的亚急性或慢性 脑膜炎病例中具有突出价值。研究表明，在CNS细菌性感染中，mNGS 比传统检测方法的总体检出率更高，但仍不能取代细菌培养等传统检测方 法，建议将mNGS与常规微生物学检测结合使用，从而提高致病菌的检 出率。mNGS在结核性脑膜炎（TBM）患者CSF的检测中具有较高的灵 敏度、特异性和阳性预测值（PPV）。mNGS的敏感性显著高
13、于传统培养 法，并且mNGS与常规方法相结合可以最大限度地提高TBM的检出率。 上述结果表明，mNGS可作为TBM诊断的前沿诊断工具。在真菌检测方 面，mNGS在诊断隐球菌性脑膜炎和脑曲霉病中的敏感性分别为76.92% 和80%,与传统检测方法结合也可显著提高检出率。在CNS病毒感染中， 同时进行DNA和RNA测序可以提高CSF品中病毒的检出率。除此之外， mNGS技术在检测诊断困难和少见的病原体上也呈现了巨大的优势，如单 核细胞增多性李斯特菌、布鲁氏菌、福氏耐格里阿米巴、脑囊虫以及创伤 弧菌。mNGS另一个应用前景是鉴别传染性和非传染性病因，并且帮助临床指导 用药。脑脊液mNGS可看做在自身
14、免疫性疾病确诊之前，排除广谱潜在 CNS传染病的适当工具。与培养法相比mNGS受抗生素药物影响更小， 但如果患者在脑脊液采样之前接受抗菌治疗时间延长，那么mNGS的检 出率将显著下降。此外，mNGS半定量可协助临床监测疾病进展和治疗效 果，但由于mNGS存在假阴性的可能，对于mNGS检测结果阴性的情况， 仍需谨慎对待。综上所述，mNGS在结核、真菌以及罕见病原体方面具有突出优势、受抗 生素影响小、可进行传染性和非传染性病因的鉴别。因此，推荐 mNGS 可作为慢性和复发性中枢神经系统感染的一线诊断方法，急性脑炎病例的 二线诊断方法。呼吸系统感染2上呼吸道感染和下呼吸道感染是临床常见病，也是造成免
15、疫抑制人群死亡 的重要因素。呼吸道感染是由病毒、细菌、真菌和寄生虫等多种病原体感 染所致，感染的病情轻重不一，严重者亦可导致肺炎。毫无疑问，病原检 测和鉴定对于精确治疗和改善患者预后至关重要，但是呼吸道感染患者常 接受经验性广谱性抗生素治疗，如频繁和不适当地使用抗生素会限制培养 法检测的敏感性和准确性。宏基因组测序技术无需预先假设，可一次性检测多种病原体，并且多项临 床研究已经证明了其可以快速、准确的协助诊断肺部复杂感染和重症感 染。众所周知，细菌是下呼吸道感染最常见的致病菌，例如铜绿假单胞菌、 肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌，除上述细菌以外，mNGS与传统的培养方 法相比可以鉴定出更多的细菌，包括结核分枝杆菌复合群（MTB）、非结 核分枝杆菌（NTM）、诺卡氏菌和各种放线菌。此外，mNGS在辅助肺部 侵袭性真菌感染、肺部混合性感染和重症无反应性肺炎诊断方面也具有一 定的价值，尤其在免疫功能低下患者的研究中，mNGS的检测准确率甚至可以达到100%。mNGS在新发病原体检测方面的优势及应用
