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1、第一天病毒感染前24小时将细胞置于12孔板。加入1ml适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。在传染当天细胞应该达到约50%平铺（Day2）。注意：也可用其它型号培养板转导。这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。第二天准备完全培养基和Polybrene（sc-134220）混合物，Polybrene终浓度为：5yg/ml。移去培养基并添加1mlPolybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12孔板）。注意：Polybrene是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10yg/ml）。过长时间暴露于
2、Polybrene（12小时）可对某些细胞产生毒性作用。在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。培养液中加入shRNA慢病毒颗粒以感染细胞。轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。注意：溶化的shRNA慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。注意：当你是第一次转导shRNA慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA慢病毒颗粒。此外，我们建议你用一孔shRNA慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。注意：用copGFP对照慢病毒颗粒：sc-108084观察转导效率。第三天移去培养液并添加1ml完全培养基
3、（不含Polybrene）。孵育细胞过夜。第四天欲选择稳定表达shRNA的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3到1:5并继续在完全培养基中孵育24-48小时。第五六天及以后用Puromycindihydrochloriede(sc-108071)筛选稳定表达shRNA的克隆。Puromycin筛选法：用足够剂量的Puromycin杀死非转导的细胞。Puromycin浓度范围为2到10yg/ml是常用计量，但对于新的细胞株建议先做Puromycin滴度。每34天更换含有新鲜Puromycin的培养基，直到耐药克隆可以被确认。选择几个克隆，扩增并进行稳定shRNA表达鉴定。注意：因为慢病毒结构整合
4、到细胞基因的数量不同，使Puromycin耐药克隆可能出现不同水平shRNA表达。注意：用蛋白免疫印迹法（WesternBlot）对shRNA进行表达分析时，细胞裂解液准备方法如下：用PBS漂洗细胞一次。细胞置于100山的2x电泳上样缓冲液（sc-24945）和PIPA裂解液（sc-24948）的1:1混合液并轻轻振动12孔板或用加样器冲打以裂解细胞。必要时冰上超声裂解。注意：如果用RT-PCR对shRNA进行表达分析，请参考P.ChomczynskiandN.Sacchi（1987.Single-stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction.Anal.Biochem.162:156-159）描述的RNA分离方法或使用商品化RNA分离试剂盒。生物安全性慢病毒颗粒可用于标准二级生物安全组织培养设施（并且需要按照同级别的其它传染性物质的要求进行处理）。慢病毒颗粒是没有自我复制功能的，并且设计为当shRNA转导并且整合到宿主DNA后，丧失其活性。
