凝胶色谱柱

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1、装柱 由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀， 否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空 泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有 平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流 动相于柱中约1/4 的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、 缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持 适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆 除漏斗，用较小的

2、滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。3、 柱均匀性检查 凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱 必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱 平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等， 加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色 谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。4、 上样 凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一 个非常重要的因素，总的原则

3、是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀 物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但 如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。 当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。用 滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。当 样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此，每一 次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢 慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。整个过程一定要仔细

4、，避免破坏凝胶柱的床层。.交联葡聚糖：葡聚糖凝胶颗粒的商品名，用于凝胶过滤，其大小不同颗 粒可用于对各种不同原子量的物质进行分离，作分子筛色谱法介质这是葡聚糖凝胶,G后面的数字代表凝胶颗粒的大小。具体操作详见，说明书啊！但是G-200的分离范围好像也不大啊，只有20万Sephadex G-100 对多糖的分离范围最大直到10万,而多糖大于十万的多得是呢 只适用于水中应用，不同规格分离不同分子量范围的化合物。sephadex g25 g25 是什么意思？参考见解：Cross-linked dextran gel G-25,葡聚糖凝胶 G-25,白色珠状颗粒。一种由葡聚糖经醚键相互交联合成具有多孔

5、性三度空间网状结构的高分子分离材料，为稳定的亲水性凝胶，G-10是表示G类凝 胶吸水量的型号。可将G后的数字除以10即为该凝胶每克干重所吸水分的毫升数。能使一定分子量范围 的大分子进入凝胶的网状结构内，不溶于水、盐 分离和提纯蛋白质、多糖、酶、核酸、激素、氨基酸、多 酞和抗菌素等。比较基础，适合新虫学习！、装柱 装柱子（添硅胶）时，常用的有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二 者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（称为固定相更为广义）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右（长度没有绝对之说，根据自身情况而定，制备的大柱可以长达一米），太短了可能分离效果不 好，太长了也会由于

6、扩散或拖尾导致分离效果不好。湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压 （土方法可以用养鱼的氧气泵加压或是用氮气，当然不加压也可以）用 淋洗剂走柱子，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。（我一般都用湿法装柱）干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧（湿法 也要敲的，效果好点），至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至 合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实（一般 柱子不敢用油泵抽，怕把柱子抽裂了）。接着是用淋洗剂走柱子，一 般淋洗剂是采用 TLC 分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。 通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以

7、加快速度。干法装柱较方便， 但最大的缺陷在于走柱子时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以 用手摸柱子明显感觉到）（梯度洗脱时，湿法装柱也会出现该情况，比 较不好处理，可以缓慢改变溶剂，且置于通风处），容易产生气泡，这 一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚（用乙醚最最明显），二氯甲烷更 为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压 力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要压结实；第二、 一定要用较多的溶剂走柱子，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅

8、胶的最上层填上一小层石英砂（我一般垫张滤纸，撒上石 英砂，再放些棉花），防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但 我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。二、上样上样也有干法和湿法之分： 干法（也称硅胶制沙）就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入 少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。 干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。（我一般喜欢用这种方法， 除非不能用）湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好， 则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴 管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后

9、， 再加入。湿法较方便，但不溶剂让其完全被硅胶均匀吸附，不容易跑的很平整 柱层析关键在于柱子是否装好（这是最大影响因素）和淋洗剂是否选择 恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC （作用还是很大的）的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外， 一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用 TLC 分析得到的 展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两 者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也 显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散 作用来分离，效果也不

10、会好。（这一点很实用，不过有些特殊情况也不 一定，如果要保险可以先做根小柱子跑一下，这样最安全，就是花点时 间）三、收集主要依靠TLC （据说国外有石英柱，直接用荧光灯照能看出来，不过太 贵了，在国内不一定适用），需要切记的是：第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂 中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分 不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开 .般以目标产物的 Rf 值在 0.3 左右为最佳。第二、点不能点得太浓（在最后时应该点的浓点，这样看看有无收尽产品）,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个第

11、三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解 性有关，只有两者比较合适才能有一个交好的分离效果。选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序 排列大概为：石油迷己烷苯乙醚 展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献（这是首选）中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就 首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果 好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效 果。不行可以尝试两两混合，三者混合，一般把两种溶剂混合时,采用高 极性/低极性的体积比为1/3 的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例, 达到最佳效果，如果没有分开的

12、迹象，最好是换溶剂。在利用 TLC 跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点 一个点A,每种难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原 料和反应体系的混合溶剂再共同点一个混合点X,这些点在板上的位 置如图所示： A X B C D这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后 的各个层份的点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点 X 的目的在于，方便观察，因为有时候，板展开后，各点的位置有些 变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。（我喜欢用小板，跑的 快，很快见到结果，为了避免小板的边缘，用机器板较好）利用 TLC 判断物质的纯度时，如果不

13、能完全确定，可以再结合其他检测手段，如NMR,因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不 等于在别的展开剂中也只显示一个点。但有趣的是，由于H-NMR可鉴别 的纯度也就在95%左右，有时候HNMR 现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。如果有标准品或是以前做过的，对个对照最方便。资料上说，将已经溶胀好的凝胶倒入柱内，当沉积的胶床至23cm高时，打开柱下端的出口，直到胶装完为止。然后再平衡,请问，当下端出口打开时，上端需不需要接上蒸馏水或 洗脱剂？我之前没有将下端口打开，自然沉降的。后来看到很多资料上说要将下端口打开， 但是没有说明上端口是否要打开接通蒸馏水获洗脱剂。需

14、要接的，如果不接的话水分只出不进，胶会干的你下端打开的时候上面继续倒凝胶呀，不要间断，最重要是的不要让气泡进入 一定要接水，这样形成的凝胶柱才会均匀，同时保证胶床不会暴漏在空气中 我用的是 C-25 凝胶的，我们先用甲醇泡，酸泡，再用碱泡。然后就装柱了 凝胶在甲醇中溶胀不够，我们一般都是放置过夜的。之前需用玻璃棒缓慢搅拌至均匀，后静 置。装住前先装装一些溶剂到柱子里，然后再将溶胀好的葡聚糖凝胶用滴管加进去，注意葡 聚糖混悬液浓度不应太大，让它自然沉降，装完后再用洗耳球压实，不会出现气泡的。有气泡必须倒出来重装！有没有人装过GE的凝胶过滤色谱柱（sephadex-G10）在固定好的层析柱中加入约

15、1/3 体积的缓冲液，关闭柱出口，在柱顶部连续加入已经充分平衡好的琼脂糖凝胶（事先把凝胶调成流动性较好的糊状物），待凝胶沉降约3cm时打开出口， 并连续加入糊状的凝胶，使其在形成的胶粒床面上连续均匀的沉降，直至凝胶完全沉降至适 当的柱床体积为止。然后关闭出口，使上层有3cm高的缓冲液并在整个层析过程中一直维 持，不能使柱子走空。为了防止柱床表面不会由于溶剂或样品的加入而引起搅动，要在柱床 表面加一个保护装置，如圆形滤纸片或纱网等。调糊也应注意。我是静置，倒出上清，加水 摇起，静置倒出上清，几次后认为替换成水了。用胶体积与整体积的约为60%时，摇匀装柱 较好，不浓也不希。看到很多虫友问葡聚糖凝胶

16、的使用方法，所以将自己的一点经验写下来，以作参考。葡聚糖 凝胶柱的使用方法大体有一下步骤：（1）预处理 称取葡聚糖凝胶（有不同型号）若干克，加入洗脱剂（通常为甲醇或者水，这里以甲醇为例） 约20倍凝胶量，置室温下3h进行溶胀，溶胀必须彻底，否则会使上柱后流速变慢，凝胶断（2）装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为 1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗 净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，接着 将溶胀好的凝胶边搅匀边缓缓连续装入，色谱柱的出口流速m维持在510ml/min。凝胶颗 粒沉积到柱底后关紧色谱柱，等沉降到l-2cm时再2打开色谱柱。直至降到满意高度为止, 等凝胶柱内的液体留的与凝胶高度差不多时，用较小的滤纸盖住凝胶床表面，再用洗脱剂洗 脱过夜。装柱后的凝胶必须均