人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达 作者：董伟，董晓慧，楚雍烈，杨娥，胡刚，郑建武 【关键词】 基因表达 摘要：目的 构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI) N端193个氨基酸的重组表达质粒，诱导表达BPI193重组蛋白方法 应用RTPCR的方法从HL60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列，克隆入T载体将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET28a中，构建重组的原核表达质粒PETBPI193，转化大肠杆菌BL21菌株，用IPTG诱导表达蛋白应用SDSPAGE检测蛋白表达情况，计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比；Westernblot技术检测表达蛋白的特异性结果 从HL60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段，构建了TBPI193亚克隆和PETBPI193重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导，经SDSPAGE检测表明，成功表达了6HisBPI193融合蛋白。
计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%Westernblot检测显示表达产物具有特异性结论 成功构建了PETBPI193重组表达质粒在大肠杆菌BL21内，诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白 关键词：杀菌/渗透增强性蛋白；基因表达；大肠杆菌 Expression of human bactericidal/permeability increasing proteinNterminal fragment in E.coli ABSTRACT: Objective To construct a prokaryotic expression plasmid of cDNA sequence encoding first 193 amino acids of BPI Nterminal and to express it in E.coli BL21. Methods Total RNA was extracted from HL60 cell and then was amplified by using RTPCR. The PCR product was cloned into pMD18T vector. BPI193 gene was directly cloned into PET28a plasmid on the role of T4 DNA ligase. PETBPI193 recombinant expression vector was transformed into competent E.coli BL21 and protein expression was induced by IPTG. Fusion protein was detected by SDSPAGE and Westernblot. Results A 579bp DNA amplicon was amplified by RTPCR. TBPI193 subclone and PETBPI193 recombinant expression plasmid was constructed successfully. 6HisBPI193 fusion protein containing 193 amino acids of BPI Nterminal was expressed by IPTG induced method. Fusion protein was detected by SDSPAGE and confirmed by Westernblot. The expressed fusion protein constituted 12% of total bacterial protein. Conclusion PETBPI193 recombinant expression plasmid was constructed successfully. To transform PETBPI193 recombinant plasmid into E.coli BL21 and 6HisBPI193 fusion protein was expressed by IPTG induced manner. KEY WORDS: bactericidal/permeability increasing protein; gene expression; E.coli 迄今为止，对脂多糖引起的并发症，如内毒素血症与败血症休克仍没有有效的治疗手段，临床治疗急需新的抗革兰阴性(G-)菌感染的药物。
人杀菌渗透增强性蛋白(bactericidal/permeability increasing protein ，BPI)是对细菌高度稳定的非催化蛋白，主要存在于人及哺乳动物多形核白细胞(PMN)的嗜天青颗粒中,也可微量表达于PMN和单核细胞表面[13]最新研究表明，BPI还可表达于嗜酸性粒细胞和上皮细胞[45]，它不仅具有特异性杀伤G-菌的作用，还可以中和内毒素，是一种具有广阔应用前景的“新型抗生素”[6]在本实验中，我们建立了稳定表达BPI氨基端(BPI193)的原核表达系统，获得了高产量的纯化蛋白，为进一步研究BPI在体内外的生物活性，研发新的BPI产品创造条件 1 材料与方法 1.1 细胞株、菌种和质粒 HL60细胞株由第四军医大学微生物教研室雷迎峰博士惠赠；E.coli DH5α和E.coli BL21为本室保存菌株；pMD18T 载体为Takara公司产品；PET28a原核表达质粒为Novagen公司产品 1.2 主要试剂 Trizol为Invitrogen公司产品；cDNA第一链合成逆转录试剂盒购自Fermentas公司；XhoⅠ、BamHⅠ限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶、T4DNA连接酶均为Takara公司产品；DEPC为Sigma公司产品；DNTPs购自北京鼎国生物公司；小剂量质粒提取试剂盒和DL2000 DNA marker购自北京天为时代公司，小分子量蛋白marker购自华美公司；溃疡性结肠炎患者血清由西安交通大学医学院第二附属医院检验科李步荣医师惠赠；山羊抗人HRPIgG购自博士德生物公司；1640培养基购自Gibco公司；DNA凝胶回收试剂盒为北京赛百盛公司产品。
1.3 1引物的设计与合成 根据GenBank数据库已收录的BPI cDNA的基因序列，借助于软件Primer Premier 5.0和DNA club设计了扩增BPI 1193个氨基酸的上下游扩增引物 P1 5′ CTGGATCCATGGTCAACCCTGGCGTCGT 3′(BamHⅠ) P2 5′ CCGCTCGAGTTACAGAGTCTGGAAATAAGG 3′(XhoⅠ) 在引物的5′端分别添加了BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，以确保酶切后可以插入PET28a原核表达载体中，并且读码框正确，还添加了起始密码ATG和终止子TAA扩增的BPI位于124-702bp，DNA长度为579bp引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成 1.4 方法 1.4.1 RTPCR扩增目的基因 用Trizol试剂从HL60细胞中提取总RNA，按试剂盒说明反转录出cDNA第一链，然后进行PCR扩增目的基因经15g/L的琼脂糖凝胶电泳分析结果后，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。
通过10g/L的琼脂糖凝胶电泳观察回收情况并目测定量 1.4.2 PCR产物与T载体的连接及鉴定 按照pMD18T载体说明书， 进行PCR回收产物和pMD18T载体的连接反应将连接产物转化感受态E.coli DH5α，经抗生素和蓝白斑筛选出阳性菌落，然后用PCR、限制性内切酶分析和DNA测序证实BPI193是否插入T载体以及基因序列有无突变 1.4.3 PETBPI193重组质粒的构建 分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切TBPI193和原核表达载体PET28a，酶切产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后，用北京赛百盛公司凝胶回收试剂盒回收，DNA定量后在T4DNA连接酶的作用下将BPI193定向克隆入原核表达载体PET28a中，构建重组的原核表达质粒PETBPI193转化大肠杆菌BL21菌株，筛选出阳性菌落，并采用PCR和限制性酶切技术鉴定，得到表达菌 1.4.4 目的蛋白的诱导表达和鉴定 用IPTG诱导表达菌，采用不同的IPTG诱导浓度(1、2、3、4mmol/L)和诱导时间(1、2、3、4、5、6h)，应用SDSPAGE技术检测细菌蛋白表达情况，获得最佳表达条件，计算机薄层扫描分析表达目的蛋白占菌体总蛋白百分比。
应用WesternBlot技术检测表达蛋白的特异性 2 结果 2.1 RTPCR扩增结果 RTPCR反应后取5μL经15g/L琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增出约602bp的基因片段，与预期大小相符 2.2 BPI193基因片段与T载体的连接 将获得的BPI193基因片段RTPCR的产物凝胶回收后，按照pMD18T载体说明书操作，双酶切结果切出约585bp和2690bp左右的基因片段，与预期相符(图1)送上海华诺公司测序，证明BPI193基因序列完全正确，命名为TBPI193 图1 重组质粒TBPI193的PCR、双酶切鉴定（略） Fig.1 Identification of plasmid TBPI193 by PCR and restriction enzyme digestion 1: DL2000 DNA marker; 2: BPI193 from PCR; 3: restriction enzyme digestion with BamHⅠ and XhoⅠ 2.3 PETBPI193重组质粒的构建 用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切TBPI193和PET28a质粒，凝胶回收试剂盒回收得到纯化产物。
用T4连接酶连接，转化E.coli DH5α，卡那霉素筛选细菌，并进行PCR和BamHⅠ＋XhoⅠ双酶切鉴定，PCR扩增出约602bp的基因片段，双酶切获得约585bp和5329bp的基因片段，与预期相符(图2) 图2 PETBPI193重组质粒的PCR、酶切鉴定（略） Fig.2 Identification of recombinant plasmid PETBPI193 by PCR and restriction enzyme digestion 1: DL2000DNA marker; 2: PCR product of TBPI193; 3:PCR product of PET。