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1、计数器计数法纽鲍尔（Neubauer）血球计数板计数操作方法如下：(1)取清洁的血球计数板，将清洁的专用盖玻片放在血球计数板上有刻度的位置。(2)将芽孢率达80%的发酵原液加入转子用磁力搅拌器振荡45min，从中取出10ml至装有90ml无菌水的250ml三角瓶中，加转子在磁力搅拌器上振荡30min，再从中取出5ml至装有45ml无菌水的100ml三角瓶中，加转子在磁力搅拌器上振荡20min，再从中取出1ml至装有9ml无菌水的试管中，在漩涡振荡器上振荡2min。依次将培养的菌液用无菌水进行适当的稀释，以每小格有3-5个细菌为宜。(3)摇匀稀释的菌液，用无菌滴管吸取少量菌液，从盖片的边缘滴一小
2、滴(不宜过多)，使菌液自行进入平台的计数室。加菌液时注意不得使计数室内有气泡，静置约5 min。在低倍镜下找到方格网后，转换高倍镜进行观察和计数；观察80个小格，以它的平均数乘以4000000，就是每毫升菌悬液中芽孢的数量。(4)计数(1625规格的计数板)细胞个数（个/ml）=80个小格内细菌数菌液稀释倍数4106/80任务微生物农药检测承担农业部或各省技术监督部门指定的微生物产品质量监督抽查检验，优质产品的评选和复查检验。受有关部门委托，对申请办理微生物农药登记的产品质量进行检验及对新产品、新品种、科研成果进行鉴定检验。承担各部门的委托检验和仲裁检验。进行微生物农药质量的研究，对外承担微生
3、物农药产品的质检服务，承担和参与相关国家标准、行业标准及企业标准的制定及试验性工作。对微生物农药产品中杂质及在农作物上施用后产生药害的物质进行鉴定和检测。对地方和企业农药质量检验机构进行技术指导、技术服务和人员培训，解决有关微生物农药质量检验的问题。食(药)用菌检测承担农业部门或其他相关部门指定的行政执法和对食(药)用菌菌种、产品及制品，食(药)用菌培养料及辅料，食(药)用菌栽培环境的质量监督检验及优质荣誉食(药)用菌产品的评选、复查、跟踪检查。受农业部或其它部门委托，对实施证书管理(如生产许可证、质量认证、进出口登记、推广许可证、产品登记等)的食(药)用菌产品进行检验，对重要新产品、新品种投
4、产和科技成果的鉴定进行检验。承担农业系统食(药)用菌产品质量考核检验和产品质量分级检验;承担有关食(药)用菌产品的质量仲裁和其他委托检验;负责对有关企业和地方同类检验机构进行技术指导、技术咨询、技术服务和人员培训。研究食(药)用菌领域新的检测技术和方法，承担或参与相关国家标准、行业标准及企业标准的制定和试验性工作。对外承担有关菌种(均一性、真实性、结实性等)、感官指标(形状、大小、虫蛀菇、杂质含量等)、理化指标(水分、灰分及各种营养成分、多糖、粗蛋白、微量元素等各种有效成分)、卫生指标(重金属残留、农药残留等各种有害成分)和微生物指标(细菌总数、霉菌总数、各种致病菌等)的质检服务。1.微生物农
5、药农药在农、林业防治病害，除去杂草中起了巨大作用，特别是化学农药，但当前全世界化学农药年产量超过200万吨，有500多种在农业中使用，造成环境严重污染，生态遭到破坏，害虫抗药性大增，人畜常中毒伤亡。1992年世界环境与发展大会的决议中指出：要在全球范 围内控制化学农药的销售和使用，到2000年生物农药的产量将占农药总量的60%。微生物农药在生物农药中占有重要地位，也是各国竞相发展的产业，它是利用微生物本身或其代谢产物防治病、虫、杂草的制剂。已知的昆虫微生物病原体1000多种，细菌10多种，真菌750多种，其余为病毒、线虫、原生动物等，这些病原体都可作为防治害虫的资源开发利用。已商品化的微生物农
6、药主要包括抗生素、细菌杀虫剂、真菌杀虫剂、病毒杀虫剂、细菌与病毒混合杀虫剂和微生物除草剂等。(1)细菌杀虫剂苏云金芽孢杆菌杀虫剂，简称Bt杀虫剂。它是当今使用最多和最广泛的生物杀虫菌，对鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、直翅目中的200多种昆虫都有毒杀作用，而且各亚种、各菌株所毒杀的昆虫对象不完全相同，有的对某种昆虫的杀灭的专一性强，毒力也高。它广泛地被用来防治农、林、果树、贮藏室和一些医学的害虫。Bt杀虫剂之所以成为国际上目前产量最大，应用面最广，深受欢迎的农药，除其杀虫效果好外，更重要的是对人、畜无伤害，安全；对植物也不产生药害，不影响农作物、树木、瓜果、烟、茶等的色、香、味；也不伤害害虫的
7、天敌和有益的生物，能保持使用环境的生态平衡；对土壤、水源、空气环境不造成污染，有利于社会经济的持续发展。苏云金芽孢杆菌的杀虫机理主要是靠其芽孢和毒素。苏云金芽孢杆菌在菌体的一端形成芽孢，另一端形成近菱形的蛋白质晶体，即伴孢晶体。不同的苏云金芽孢杆菌菌株的伴孢晶体所含的晶体蛋白种类和数量有很大差异，一般都含有1-5种杀虫晶体蛋白，其分子量 在27-140KD之间，这些晶体蛋白本身并不能杀虫，它只是毒素的前体。当昆虫吞食伴孢晶体后，在肠道中的碱性条件下，伴孢晶体被分解出毒素的前体，或称为原毒素(Protoxin)，再在肠中特异性的碱性蛋白酶作用下，水解出有活性的不同分子量的毒性多肽，被称为苏云金芽
8、孢杆菌的内毒素。内毒素特异性地结合在肠道的上皮细胞的糖蛋白受体上，在细胞膜上产生一个直径约为10-20埃的孔，或形成病灶，造成钠离子和钾离子的调节泵失去作用，钾的运输和ATP的合成中断，细胞代谢停止，昆虫死亡(图15-14)。有的苏云金芽孢杆 菌还产生另一种称为-外毒素的毒素，也被称为苏云金素，它是一种非特异性的小分子腺嘌呤核苷酸衍生物，相对分子质量约为700。-外毒素比-内毒素热稳定性好，可忍耐121，15分钟，可以溶于水，作用机理和致病症状也不相同，-外毒素是RNA聚合酶的竞争性抑制剂，干扰与昆虫发育有关的激素的合成，导致幼虫发育畸形或不能正常化蛹。苏云金芽孢杆菌的芽孢被昆虫吞食后，在肠道
9、中萌发成营养体，大量增殖，并穿透肠壁进入血液繁殖，使昆虫为败血症死亡(图15-14)。苏云金芽孢杆菌杀虫剂的生产，可以用深层液体(或固体)好氧发酵，相对于生产抗生素、氨 基酸、维生素等的发酵工艺要简易、粗放得多。后处理也较容易，液体发酵一般是用发酵液喷雾干燥，或将发酵液制成液体制剂，固体发酵更为简便，大都是发酵后，即进行干燥、粉碎、检验、产品。农村还可推广家庭室内地面固体发酵法生产Bt杀虫剂，其要点是：将麦麸 70%，黄豆饼粉20%、谷壳9%、碳酸钙1%，加水，干料水=10.8-1.2，用熟石灰水调pH9 左右，培养基的含水量以手捏成团，触之能散为宜。培养基所用原料可因地制宜，还可以用米糠、棉
10、籽饼粉、花生饼粉、玉米粉、蚕蛹粉、草炭粉、肥土等制备培养基。用蒸煮法灭菌培养基后，接种Bt菌种，将其松散地摊放在垫有一层塑料薄膜的室内地面上，培养基厚1厘米左右，上面也罩以塑料薄膜，使发酵温度自动控制在25-32为宜，48小时左右，可获得含活芽孢数约100亿/克左右的Bt杀虫剂，即可用于棉田、蔬菜、瓜果、森林等防治害虫。图15-14苏云金芽孢杆菌致死昆虫的主要机理模式图Bt杀虫剂不足之处是：1.杀虫效果受环境影响大。如15以下不宜使用；阳光中的紫外线能 使伴胞晶体的杀虫蛋白失效，24小时破坏蛋白质中60%的色氨酸。2.各种Bt菌株仅对其敏感的昆虫有效，杀虫谱窄，一株菌种生产的杀虫剂一般不能防治
11、多种虫害。3.昆虫对Bt杀虫剂逐渐产生可遗传性的抗性。4.必须经过吞食过程进入昆虫体内才能杀死昆虫，很难杀死钻入植物体内和根部的害虫，而且只能在昆虫发育的某一阶段才有好的使用效果。这些不足之处，可以用各种各样的方式补救，例如：在制剂时添加防紫外线破坏的保护剂，加入蔗糖提高昆虫嗜食性，添加几丁质酶加强昆虫肠壁破坏，加入K2CO3、CaCl3等阳离子加速伴孢晶体降解，增加杀虫剂的效力；生产菌种不断筛选和更换；与少量化学农药混合使用，增强对昆虫的敏感性。但最重要的是用现代生物学技术对苏云金芽孢杆菌进行基因改造，使重组Bt菌株具有杀灭多种害虫的内毒素或-外毒素基因，或具有某些保护、增效物质产生的基因，
12、并高效表达，生产出受环境影响小、杀虫谱广、防昆虫抗性的强效Bt杀虫剂。 目前国内外这方面的研究很火热，而且也有了工程菌株生产的Bt杀虫剂。将苏云金芽孢杆菌的毒素基因转入其它微生物或植物，这不仅仅是解决Bt杀虫剂需要昆虫吞食等方面的不足的问题，而是农药和防治害虫战略方面的重大变革。将苏云金芽孢杆菌基因克隆到荧光假单胞菌的染色体DNA上，这种菌在玉米根周围土壤中繁殖，杀死土壤中伤害作物根系的昆虫很有效。美国Mycogen公司将这种重组的荧光假单胞菌发酵增殖，然后用加热或浸碘的方法灭活菌体，但这种革兰氏阴性菌灭活后其细胞膜和壁可形成微囊，将有活性的毒蛋白包裹在其中，提高了抗紫外线等环境对其损伤的能力
13、，其有效杀虫时间比普通的重组菌杀虫剂延长了两周以上。Mycogen公司现已获准上市销售杀蔬菜害虫、马铃薯甲虫和玉米螟的三种这类工程菌杀虫剂。转基因抗虫植物，至1998年4月止，各国批准大田释放的已达1046项，占批准的转基因作物的23.8%。我国也批准了十多项转基因抗虫植物进入大田释放。转基因植物中起抗虫作用的绝大多数都是苏云金芽孢杆菌的毒素基因，而且在作物中表达好，使作物抗虫效果较显著。 其它细菌杀虫剂还有金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae，即日本甲虫芽孢杆菌)杀虫剂，该菌是金龟子幼虫(蛴螬)的专性病原。蛴螬吞食金龟子芽孢杆菌后，在中肠内萌发，生成营养体，穿过肠壁进入体腔，
14、迅速繁殖，破坏各种组织，并可感染其它蛴螬，使金电子幼虫大量死亡。该种杀虫剂能使50余种金龟子幼虫致病，而且药效能保持9年之久，是一种成功地用于防治金龟子虫害的长效微生物农药。金龟子芽孢杆菌只能在蛴螬体内形成大量孢子，在一般人工培养基上很少形成孢子，因而该杀虫剂的生产，目前仍主要是靠感染活蛴螬大量产生芽孢来进行。球形芽孢杆菌(B.sphaericus)某些菌株对蚊幼虫有毒杀作用，主要是由其伴胞晶体中的毒素蛋白使昆虫致死，毒素蛋白是由51和42KD两种蛋白组成，此毒素为二元毒素，只有这两种蛋白共同参与才具有杀蚊活性。球形芽孢杆菌杀蚊剂的生产工艺与苏云金芽孢杆菌杀虫剂的相似，已有批量产品，是一种灭蚊
15、除病害，有益于健康的微生物卫生防疫制剂，很值得推广。(2)真菌杀虫剂典型的代表是白僵菌杀虫剂。白僵菌(Beauveria bassiana)是一种广谱性寄生真菌，广泛地使昆虫致病，由该菌引起的病占昆虫真菌病约21%，能侵染鳞翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目、同翅目的众多昆虫及螨类。白僵菌接触虫体感染，适宜条件下其分生孢子萌发，分泌几丁质酶，溶解昆虫表皮，侵入体内增殖，并分泌毒素(白僵菌素)和草酸钙 结晶，破坏寄主的组织，使代谢机能紊乱，最后因虫体上生出白色的棉絮状菌丝和分生孢子梗及孢子堆，整个虫体水分被菌吸收变成白色僵尸，菌因此而得名。用白僵菌生产杀虫剂的原料、工艺都与苏云金芽孢杆菌杀虫剂生产大同小异，也可用深层液体好氧培养或固体培养。该杀虫剂在防治松毛虫、玉米螟、大豆食心虫、高梁条螟、甘薯象鼻虫、马铃薯甲虫、果树红蜘蛛、枣粘虫、茶叶毒娥、稻叶蝉、稻飞虱等农林害虫，效果较显著。绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)制成的杀虫剂也是一种广谱真菌杀虫剂，它侵染昆虫的途径、致病机理和生产方式都与白僵菌杀虫剂相似，但要求的培养温度、湿度较严格。该菌剂防治斜纹夜娥、棉铃虫、地老虎、金龟子等害虫，效果较好。(3)病毒杀虫剂它是基于许多病毒能使害虫致病死亡，并且对人、畜和作物安全，杀虫作用具有流行性和可持续性而制作的。1973年，联合国粮农组织(FAO)
