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1、Cell Quest Pr双色淋巴细胞亚群分析样本制备【实验目的】:使用双色组合标记抗体对人外周血中淋巴细胞亚群进行检测,了 解人的免疫状态。从而指导临床诊断和治疗。【实验原理】:利用荧光技术,在不同的鼠抗人的抗体上标上荧光素,此荧光抗 体就同人淋巴细胞表面的CD分子特异性的结合;然后用流式细 胞仪检测,结合分析软件的自动分析,便可以得出各亚群细胞的百 分比。【主要试剂】:1、流式细胞仪(FACSCalibur)、台式离心机、涡旋震荡器,微量 移液器(1000皿、200皿、20皿,流式细胞专用试管、鞘液;PBS (加0.1%叠氮钠)2、双色检测试剂:Isotype Control(MouseI
2、gG1/IgG2a) CD3-FITC /CD19-PE C D3-FITC /CD4-PE CD3 FITC /CD8-PE C D3-FITC /CD16+CD56-PE3、FACS Lysing Solution红细胞裂解液(10X,使用前用蒸馏水 稀释成1X)。4、1%的多聚甲醛配制方法:称1.0克多聚甲醛加少量PBS放入56r水浴箱中使之溶解,用 1N NaOH溶液和1N的HCl调整PH值在6.97.0,然后加入100ml 容量瓶中定容;最后用0.45um的滤膜过滤。【实验步骤】:1、取5支流式试管,编号为1、2、3、4、5,分别取100但抗凝 全血加入每支试管中,不要碰到管壁。2、
3、轻轻混匀,依次加入 20pl 双标 Isotype Control (Mouse IgGJ IgG2a)、CD3/CD19、CD3/CD4、CD3/CD8、CD3/CD16+CD56 荧光抗体。室温避光保存20分钟。3、取出试管,每管加入10倍稀释了的1XFACS Lysing Solution 2ml,涡旋混匀,避光10分钟。待管内液体透亮。然后300g 离心5min,弃去上清液。4、每管加入2ml的PBS,涡旋混匀,300g离心5min,弃去上清 液。然后加入0.5ml PBS混匀,4C避光1h内上机检测;若不 能及时上机,加入0.5ml含1%多聚甲醛的PBS,放4C冰箱保 存,48h内上机检测。